α-倒捻子素對奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細胞促炎反應(yīng)的抑制作用

傅業(yè)全 ， 侯曉林 ， 崔德鳳 ， 胡 格 ， 王建舫 ， 劉 洋 ， 韓 博

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193； 2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 昌平 102206)

奶牛乳房炎是危害奶牛行業(yè)的世界性難題，全球范圍內(nèi)每年因此造成巨大的經(jīng)濟損失。該病是由多種因素引起的奶牛乳腺組織炎癥，其主要原因是病原微生物的入侵[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一[2]，尤其是隱性奶牛乳房炎。由于金黃色葡萄球菌具有能夠產(chǎn)生多種毒力因子、易產(chǎn)生耐藥性以及侵入奶牛乳腺上皮細胞(bMECs)逃避抗生素的作用等特點，使得金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的防治更加困難，找尋合適的藥物成為防控金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的關(guān)鍵。

山竹是一種分布在東南亞國家及我國的廣西壯族自治區(qū)和海南、福建、臺灣等省的熱帶水果，其營養(yǎng)成分豐富，有“水果皇后”之稱。在泰國等地山竹果皮一直作為傳統(tǒng)醫(yī)藥被長期應(yīng)用，主要用來治療皮膚感染、腹瀉、痢疾、霍亂、慢性潰瘍等疾病。山竹果皮中含有多種藥物活性成分，主要包括α-倒捻子素、β-倒捻子素和γ-倒捻子素。研究表明，α-倒捻子素具有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化等多種功效[3-4]。α-倒捻子素雖然在人類醫(yī)學(xué)中表現(xiàn)出多種生物活性與藥理作用，但在畜禽方面的報道甚少，更未見其對奶牛乳房炎作用的相關(guān)報道，為此本試驗借助金黃色葡萄球菌感染bMECs，研究α-倒捻子素對奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌引起bMECs的炎性反應(yīng)的影響，以期為防治奶牛乳房炎提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 bMECs細胞系(MAC-T)和金黃色葡萄球菌臨床分離株均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)實驗室提供。

1.2 試驗分組 試驗分為對照組(Control,C)和試驗組。其中對照組為未進行任何處理的bMECs；試驗組分為金黃色葡萄球菌組(S)、α-倒捻子素低、中和高濃度組，分別用金黃色葡萄球菌和終濃度為0、0.4、0.8 μg/mL和1.6 μg/mL的α-倒捻子素對bMECs進行處理。

1.3 儀器設(shè)備 CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO)；超凈工作臺(泰斯特儀器有限公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；Real-time PCR System(美國Applied Biosystem公司)；低速離心機(湖南湘儀)；高速離心機(美國Sigma公司)；移液器(德國Eppendorf公司)。

1.4 試驗試劑和耗材 DMEM/F12培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；青鏈霉素合劑(100×，北京索萊寶科技有限公司)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；RNAprep Pure細胞總RNA提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；Quant cDNA 第1鏈合成試劑盒；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green，碧云天生物技術(shù)有限公司)；細胞培養(yǎng)板(美國康寧公司)；α-倒捻子素標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶科技有限公司)；腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6) ELISA試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)；NF-κB p65相關(guān)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.5 試驗方法

1.5.1 bMECs的復(fù)蘇和準(zhǔn)備 凍存的bMECs迅速解凍后，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含10% FBS、1%雙抗)懸浮細胞，然后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放于細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中進行培養(yǎng)，至細胞匯合后進行常規(guī)傳代。傳代24 h后接種至細胞培養(yǎng)板進行試驗。

1.5.2 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng) 凍存的菌種融化后，用細菌接種環(huán)挑取適量菌液在MHA平板上劃線，將平板置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后可見平板培養(yǎng)基表面出現(xiàn)邊緣光滑、透明的單個菌落。挑取單個菌落接種于MHB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)18 h左右，測定OD600值為1.0時停止培養(yǎng)。使用無菌PBS(pH 7.4)對上述金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物進行倍比稀釋后，取各稀釋后的菌懸液涂于TSA培養(yǎng)基平板上，進行菌落計數(shù)。金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物保存于4 ℃冰箱中，用于后續(xù)試驗。

1.5.3 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)測定 按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical & Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)采用微量肉湯稀釋法測定MIC，質(zhì)控菌選擇金黃色葡萄球菌ATCC29213標(biāo)準(zhǔn)株。在96孔板上進行操作，每孔終體積為200 μL，第1孔加入α-倒捻子素的體積為20 μL。采用倍比稀釋的方法使第1～10孔中的α-倒捻子素的終濃度依次為51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 μg/mL和0.1 μg/mL，在每排前10孔各加入稀釋后的菌液100 μL(1×105CFU/mL)。第11孔加入200 μL MHB肉湯作為陰性對照，第12孔加入200 μL稀釋后的菌液作為陽性對照。試驗設(shè)5個重復(fù)。

1.5.4 α-倒捻子素對bMECs增殖的影響 將bMECs按1×104個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細胞融合后，棄去培養(yǎng)液，加入含不同質(zhì)量濃度的α-倒捻子素(0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μg/mL和25.6 μg/mL)的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL 的CCK-8溶液，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測光密度值。

1.5.5 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌侵入bMECs的影響 將bMECs按5×105個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)12～16 h后棄掉上清液，PBS洗滌3次后更換DMEM/F12不完全培養(yǎng)基(含1%FBS，不含雙抗)培養(yǎng)2 h，2 h后按感染復(fù)數(shù)(MOI)(細菌∶細胞)=100分別加入準(zhǔn)備好的金黃色葡萄球菌懸液和終濃度為0、0.4、0.8 μg/mL和1.6 μg/mL的α-倒捻子素，37 ℃繼續(xù)孵育3 h，然后棄掉細胞培養(yǎng)液并用PBS洗滌3次，每孔加入1 mL 含100 μg/mL慶大霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)孵育2 h，以殺死胞外黏附的金黃色葡萄球菌。用PBS洗滌3次，加濃度為0.25%的胰蛋白酶消化細胞，再加0.1% TritonX-100作用10～15 min裂解細胞，收集細胞裂解液，使用無菌PBS對裂解液進行倍比稀釋后，取各稀釋度涂布于TSA平板上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后計數(shù)，每組設(shè)3個重復(fù)，計算入侵指數(shù)。入侵指數(shù)=入侵的細菌總數(shù)/金黃色葡萄球菌組的入侵細菌數(shù)。

1.5.6 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌感染bMECs的TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響 用金黃色葡萄球菌和α-倒捻子素按1.5.5方法處理3 h，用PBS洗滌3次，用濃度為0.25%的胰蛋白酶消化細胞，收集細胞懸液至離心管中1 200 r/min離心5 min， 吸凈上清，收集細胞沉淀。按RNAprep Pure細胞總RNA提取試劑盒說明書提取細胞RNA，然后按照Quant cDNA 第1鏈合成試劑盒要求轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，1個 循環(huán)；95 ℃變性10 s，58 ℃延伸20 s，72 ℃退火30 s，40個循環(huán)。基因的引物序列見表1，由生工生物工程(北京)股份有限公司合成。采用β-actin基因作為內(nèi)參基因[5]。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt表示。

表1 RT-PCR引物Table 1 Real-time PCR primers

1.5.7 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌感染bMECs的TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子的影響 按1.5.5方法用金黃色葡萄球菌和α-倒捻子素處理bMECs 3 h，收集細胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心10 min。取上清按ELISA試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白的表達水平。

1.5.8 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌感染bMECs的NF-κB蛋白p-p65表達的影響 按1.5.5方法用金黃色葡萄球菌和α-倒捻子素處理bMECs 3 h，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，加濃度為0.25%的胰蛋白酶消化細胞，然后加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋白酶，收集細胞懸液至離心管中1 200 r/min離心5 min，吸凈上清，收集細胞沉淀。按BCA蛋白提取試劑盒要求提取蛋白，應(yīng)用Western Blot方法進行分析檢測。使用 Image J軟件對Western Blot檢測樣品條帶進行灰度值分析，以磷酸化NF-κB p65/β-actin條帶灰度值比值反映NF-κB信號通路的活化水平。

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 8分析數(shù)據(jù)并作圖，用方差分析進行組間比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌的MIC 將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱于37 ℃孵育24 h后，讀取結(jié)果，陰性孔呈清亮，陽性孔呈渾濁，抑制金黃色葡萄球菌生長的最低藥物濃度為1.6 μg/mL。

2.2 α-倒捻子素對bMECs增殖的影響 用含不同終濃度的α-倒捻子素培養(yǎng)液培養(yǎng)bMECs，通過CCK-8試劑盒法檢測α-倒捻子素對bMECs增殖的影響。結(jié)果如圖1所示，α-倒捻子素在0.4～3.2 μg/mL 濃度范圍對bMECs的增殖沒有明顯的影響(P>0.05)，在濃度為6.4 μg/mL時細胞增殖受到抑制(P>0.05)，在濃度為12.8 μg/mL和25.6 μg/mL 時細胞活力顯著下降(P<0.01)。因此，選擇終濃度為0.4、0.8 μg/mL和1.6 μg/mL的α-倒捻子素用于后續(xù)試驗。

圖1 α-倒捻子素對bMECs增殖的影響Fig.1 Effect of α-mangostin on viability of bMECs**：與0 μg/mL相比,差異極顯著(P<0.01)**：Significant difference comparing with 0 μg/mL (P<0.01)

2.3 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌侵入bMECs的影響 結(jié)果如圖2所示，低、中和高3個濃度組的α-倒捻子素均能顯著抑制金黃色葡萄球菌對bMECs的侵入(P<0.01)。其中中濃度組對S.aureus入侵bMECs的抑制作用弱于另外2個濃度組，但仍然具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 α-倒捻子素對S. aureus侵入bMECs的影響Fig.2 Effect of α-mangostin on invasion of S.aureus into bMECs**：與金黃色葡萄球菌組(S)相比，差異極顯著(P<0.01)**：Significant difference comparing with S.aureus group (S)(P<0.01)

2.4 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌感染bMECs的TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達的影響 結(jié)果如圖3所示， 與對照組相比，S.aureus感染3 h后顯著提升bMECs中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)。同時，低、中和高3個濃度組的α-倒捻子素均能夠顯著抑制由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致bMECs的3種促炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)(P<0.01)， 且TNF-α、IL-1βmRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別與α-倒捻子素呈濃度依賴關(guān)系。

圖3 α-倒捻子素對TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響Fig.3 Effect of α-mangostin on expression levels of TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA ##：金黃色葡萄球菌組(S)與對照組(C)相比,差異極顯著(P<0.01)； **：與金黃色葡萄球菌組(S)比較，差異極顯著(P<0.01)；下圖同##：Significant difference between S.aureus group (S) and control group (C) (P<0.01);**：Significant difference comparing with S.aureus group(S) (P<0.01). The same as below

2.5 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌感染bMECs的TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子水平的影響 結(jié)果如圖4所示，與對照組比較，S.aureus感染bMECs 3 h后顯著提升培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和IL-6 蛋白表達水平(P<0.01)。同時，低、中和高3個濃度組的α-倒捻子素均能夠顯著抑制bMECs由于金黃色葡萄球菌感染所致的3種促炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)(P<0.01)，且TNF-α、IL-1β 蛋白表達水平分別與α-倒捻子素呈濃度依賴關(guān)系。

圖4 α 倒捻子素對TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響Fig.4 Effect of α-mangostin on expression levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 protein

2.6 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌感染bMECs的NF-κB p-p65蛋白表達的影響 結(jié)果如圖5所示，在金黃色葡萄球菌感染bMECs 3 h后，金黃色葡萄球菌組的bMECs中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平顯著高于對照組細胞(P<0.01)。同時，低濃度組和高濃度組的α-倒捻子素能夠顯著抑制NF-κB p65蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。但是，中濃度組的bMECs的NF-κB p65蛋白的磷酸化水平平均值略低于金黃色葡萄球菌組，二者差異不顯著(P>0.05)。

圖5 α-倒捻子素對NF-κB p-p65蛋白表達量的影響Fig.5 Effect of α-mangostin on expression levels of NF-κB p-p65 protein

3 討論

3.1 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌的MIC 本試驗通過微量肉湯稀釋法測得α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌的MIC為1.6 μg/mL，這一結(jié)果與Koh等和李干龍的研究結(jié)果接近(0.78～1.56 μg/mL)[6-7]，說明α-倒 捻子素對奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌有較強的抗菌作用。

3.2 α-倒捻子素對bMECs增殖的影響 本試驗中，α-倒捻子素終濃度為0～3.2 μg/mL時，對bMECs的增殖未見明顯的抑制作用。但濃度在6.4 μg/mL 時抑制了bMECs的增殖，當(dāng)濃度達到12.8 μg/mL時呈現(xiàn)出較強的細胞毒性作用(P<0.01)，這與周孝君的研究結(jié)果相一致[8]，說明α-倒捻子素對bMECs的毒性較強，在試驗和應(yīng)用時需謹慎，所以后續(xù)試驗選擇了0～1.6 μg/mL作為研究劑量，以減少細胞毒性對結(jié)果的影響。若能降低其細胞毒性，其應(yīng)用前景將十分廣闊。如鄒漢勛以α-倒 捻子素為母核，在α-倒捻子素兩端加入陽離子，模擬抗菌多肽的結(jié)構(gòu)和功能，極大地減弱了其細胞毒性，顯著提高其對細菌的抗菌活性，具有很好的生物選擇性[9]。

3.3 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌侵入bMECs的影響 金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要傳染性病原菌，對宿主細胞的侵襲是其持續(xù)感染的關(guān)鍵所在[10]。本試驗中低濃度組和高濃度組的α-倒 捻子素均顯著抑制金黃色葡萄球菌的入侵，說明α-倒捻子素具有預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的作用，但中濃度組的α-倒捻子素抑制入侵效果減弱，其具體的原因需深入探討。

3.4 α-倒捻子素對金黃色葡萄球菌感染bMECs炎性反應(yīng)的影響 bMECs作為抵御病原微生物入侵的第一道屏障，除具有泌乳功能外，還參與先天性和獲得性免疫反應(yīng)，在保護乳腺組織方面發(fā)揮作用[11]。當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入奶牛乳腺組織并引發(fā)乳房炎時，bMECs能夠合成和分泌多種免疫活性物質(zhì)，如IL-6、IL-1β、IL-8以及TNF-α等[11]。在本試驗中，金黃色葡萄球菌侵染bMECs 3 h，3種炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達和分泌升高，表明金黃色葡萄球菌引起bMECs炎性反應(yīng)。低、中和高3個濃度組的α-倒捻子素能夠明顯降低炎性基因的表達和炎性因子的分泌，TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達分別與α-倒捻子素呈濃度依賴關(guān)系。α-倒捻子素在本試驗中表現(xiàn)出抗炎作用，NF-κB信號通路p-p65蛋白的檢測結(jié)果也支持這一觀點，但NF-κB信號通路的活化是否是α-倒捻子素的直接作用有待進一步研究。Supinya等[12]研究顯示，α-倒捻子素對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞釋放NO、PGE2、TNF-α和IL-4具有抑制作用。Bumrungpert等[13]發(fā)現(xiàn)，α-倒捻子素和γ-倒捻子素能夠降低炎性基因TNF-α、IL-6以及MCP-1的表達來抑制LPS引起的脂肪細胞炎性反應(yīng)。Shen等[14]發(fā)現(xiàn)，α-倒捻子素能夠抑制炎癥反應(yīng)和氧化損傷來保護脂肪細胞，其機制可能是通過激活Nrf2信號通路實現(xiàn)的。Liu等[15]研究α-倒捻子素對LPS介導(dǎo)的人骨髓白血病細胞系U937細胞的抗炎效果發(fā)現(xiàn)，α-倒捻子素通過下調(diào)EIK-1、MMK3/MMK6和MAP-KAPK-2的磷酸化水平，抑制MAPK信號傳導(dǎo)通路，從而發(fā)揮抗炎作用；同時也抑制TNF-α和IL-4的產(chǎn)生并且存在劑量依賴關(guān)系，說明α-倒捻子素通過MAPK和NF-кB 信號通路發(fā)揮抗炎效果。在本試驗中，中濃度組的α-倒捻子素在抵御金黃色葡萄球菌入侵、IL-6 mRNA表達和蛋白分泌等方面均與其他劑量組有差異，推測該濃度的α-倒捻子素啟動了炎性通路的某一環(huán)節(jié)。α-倒捻子素抗菌的作用機理之一是其作用于細胞膜，引起細胞膜的流動性、膜兩側(cè)電荷和離子通道改變，誘發(fā)Ca2+濃度的變化，導(dǎo)致細胞功能的改變[7,16-17]。陳建軍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，低、中、高濃度鈣離子對炎癥因子IL-6的影響差異較大，低濃度組降低血清IL-6的水平，中濃度組對血清IL-6的水平幾乎無影響，而高濃度組提高血清IL-6的水平。但是低高濃度組出現(xiàn)了異常血鈣并發(fā)癥，而中濃度組未出現(xiàn)，說明鈣離子與炎癥通路之間存在某種聯(lián)系。唐亞等[19]、王清華等[20]和周仁鵬[21]均證實炎癥因子與離子通道之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。因此推測本試驗中中濃度組的α-倒捻子素表現(xiàn)出了與其他劑量不同的趨勢，可能有如下原因：(1)該濃度的α-倒捻子素很可能激活細胞膜相關(guān)的離子通道，使離子濃度發(fā)生改變，進而影響炎癥通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，影響IL-6的水平；(2)該濃度的α-倒捻子素作用于細胞膜，引起細胞流動性改變，暴露膜受體并與之結(jié)合，進而影響IL-6的水平。

綜上所述，α-倒捻子素對奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌有較強的抗菌作用，能顯著抑制奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌對bMECs的侵襲，進而引起bMECs 中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平改變，抑制炎性反應(yīng)，其抗炎的分子機理可能與NF-κB信號通路相關(guān)。