Ras-Raf-MAPK/ERK信號通路在正畸牙周組織改建中的表達及調控機制

袁熳 綜述 張疆弢，梅梅 審校

遵義醫科大學附屬口腔醫院正畸科一組，貴州 遵義 563000

正畸牙齒移動是在機械刺激下引起的牙周組織改建即牙槽骨重塑過程，施加在牙齒上的機械刺激通過牙周膜傳遞到牙槽骨，導致壓力側的骨吸收和張力側的骨形成[1]。牙周膜(PDL)細胞成分主要由成纖維細胞樣細胞組成，但PDL組織還具有一個多潛能的間充質干細胞群，分化為成骨細胞和成牙骨質細胞[2]。牙周膜干細胞(PDLSCs)在牙周組織中具有再生組織的功能，包括PDL和牙骨質[3]。在正畸牙移動過程中，牙周膜干細胞可誘導牙周膜細胞成骨分化及參與牙周組織新陳代謝的調控、牙周組織改建，促進正畸牙移動。牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament fibroblast，PDLF)是牙周膜細胞的主要細胞類型，它們在受到包括機械細胞變形在內的多種刺激下分化為成骨細胞[4]。牙周膜持續受到各種機械力的影響，這些機械載荷由牙周膜成纖維細胞接收后[5]，將物理信號轉化為生物化學信號和特定基因的表達，組織對機械信號的轉導可激活一系列信號通路轉導途徑，各種研究表明，施加力可以激活PDLSCs中不同的信號通路，包括MAPK、TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路[4]。有研究表明，機械刺激新生大鼠骨髓間充質干細胞可激活多條非特異性的機械敏感性途徑(包括整合素、轉化生長因子β/BMP、Akt、MAPK、胰島素和Wnt 途徑)，其活性通過Ras-Raf絲裂原激活蛋白激酶(MEK)-細胞外信號調節激酶(ERK)級聯反應來刺激成骨和軟骨的形成，然而，Wnt通路在成骨和軟骨發生方面的作用不太明顯[6]。

Ras-Raf-MEK-ERK軸(也稱為Ras-MAPK通路)在細胞信號傳導中起著中心作用，基因小鼠模型已經證明了Ras-MAPK通路在軟骨細胞和成骨細胞分化和功能中的重要性[7]。越來越多的學者開始關注Ras-Raf-MAPK/ERK信號通路參與正畸牙移動的相關研究[8]，這將為加快牙周組織改建的速度提供有利數據。

1 Ras-Raf-MAPK/ERK的表達及調控

1.1 腎素-血管緊張素系統(Ras)表達及調控 Ras家族成員由KRAS4A、KRAS4B、HRAS和NRAS組成。Ras是一種膜結合的小GTP酶，它可以傳達對各種細胞外信號的反饋[9]。經典Ras 具有多種效應蛋白，包括Raf(ARaf、B-Raf 和C-Raf)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和Ral 鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)。Ras 主要效應因子是AngⅡ[10]。AngⅡ可通過ERK信號通路加快成骨細胞的表達、分泌成骨相關因子RANKL，并使其與表達于破骨前體細胞表面的RANK結合，從而發生破骨過程[11]。有研究與誘導成骨細胞分化及與機械應力介導的MAPK 通路下調相關的下游分子，Ras 可能代表MAPK 通路中參與成骨細胞反應的靶點[7]。當Ras受到多種細胞表面受體的刺激時，ERK1/2被激活。活化的Ras 刺激c-Raf，后者反過來磷酸化ERK1/2 的主要上游磷酸化物MEK1，活化的MAP激酶隨后可磷酸化下游底物，以調節細胞增殖、分化和凋亡[12]。在力介導的生長抑制過程中，Ras通過激活MAPKs將機械信號轉移到細胞核中，發現p38 MAPK 激活與Ras 信號傳導相關，因為用特異性抑制劑抑制Ras 時，p38 MAPK 活性即被抑制，并增加了細胞的DNA 合成[5]。有研究表明，Ras抑制劑幾乎完全阻止了p-p38 MAPK和p-p21 的張力介導的增加，以及牙周膜成纖維細胞(PLF)的增殖，在張力作用下Ras 可以激活PLF 中的Ras-p38 MAPK 通路[5]。在HPDLCs中，誘導白細胞介素-11 (IL-11)表達的信號通路是通過AT2 受體介導的，通過拉伸負荷和rhAng Ⅱ治療，轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達增加，TGF-β1也誘導人成纖維細胞中IL-11基因的轉錄。IL-11是IL-6家族的一員，可以作為一種促炎性細胞因子，對拉伸牙周膜成纖維細胞具有成骨作用。總的來說，這些數據清楚地表明RAS參與了拉伸載荷下HPDLCs中IL-11的產生。以前的研究表明IL-11對PDL細胞有成骨作用[13]。即RAS參與了正畸牙周組織改建過程。拉伸應變和血管緊張素(AngⅡ)表達的上調通過血管緊張素(AT2)受體和Ras促進IL-11的產生[14]。此外，Ras是MAPKs、ERK1/2和p38 的上游介導因子，ERK1/2 介導的Runx2 激活依賴于Ras。Runx2是成骨過程中最早連續表達的蛋白質，是一種特定轉錄調節因子，它標志成骨分化的開始，并且在成骨細胞分化和骨形成中起重要作用[15]。有報道稱，整合素介導的Ras相關信號轉導級聯為ECM-整合素引發的MAPK相關細胞內事件提供了主要途徑，因為信號在Runx2 激活期間進入了Ras-MEK-ERK 途徑。Westernblot 分析顯示Ras 信號的缺失抑制了ERK1/2信號傳導[16]。RAS可以激活RAS/MAPK信號通路中的RAF-1。RAF-1直接參與ERK的激活，基因小鼠模型已經證明了Ras-MAPK 通路在軟骨細胞和成骨細胞分化和功能中的重要性[7]。Ras 信號轉導與力誘導的PLF 生長抑制密切相關，Ras 通過激活MAPKs將機械信號傳遞到細胞核，機械轉化整合素受體的起始因子，可觸發銜接蛋白的下游激活，如黏著斑激酶(FAK)、Rho 家族蛋白和小窩蛋白。整合素FAK-Ras-MAPK 信號級聯可能與成纖維細胞的機械傳導密切相關[5]。有研究證明，受體抑制劑氯沙坦(LOS)通過阻斷AT1R后，破骨細胞的募集和活性降低，首次表明了LOS通過對Ras的阻斷，減少了機械力誘導的骨重塑，正畸患者如長期使用Ras抑制劑可能會減緩牙齒的移動，延長治療時間[10]。這些研究表明Ras-MAPK通路在骨軟骨祖細胞的分化以及成骨細胞的功能中具有重要作用。

1.2 Raf 表達及調控 Raf 蛋白是Ras 蛋白的主要效應器[9]。Raf能被Ras家族的小GTP酶引導激活，不活躍的Ras-GDP受到上游受體的生長因子刺激下，在質膜中轉化為活躍的Ras-GTP 形式[17]，促使Raf 向膜轉移并形成Rafa-Ras-GTP復合物[18]。Raf激酶激活后，進一步磷酸化而激活激酶MEK1 和MEK2，激酶MEK1和MEK2磷酸化后并激活ERK1和ERK2[19]。最近的數據表明，Raf激酶結構域的二聚化是Raf激活中Ras調控的中樞事件，Raf激酶家族構成Ras-Raf-MAPK/ERK信號級聯反應的核心成分[20]。有研究表明，在僅表達C-Raf的細胞中，ERK被滅活并抑制增殖，而在表達B-raf的細胞中，ERK被激活并誘導增殖。該實驗已被證明對成骨細胞有效，此外有體外實驗結果支持Raf/MEK/ERK 通路在軟骨細胞增殖中的作用[21]。RAF 通過MAPK/ERK 將激活的RAS 蛋白信號傳遞給ERK1/2，這是該通路的關鍵效應器，研究證實RAF-1與細胞增殖和成骨細胞分化有許多聯系[22]。有研究表明，在小鼠成纖維細胞中，癌基因和生長因子誘導的COX-2轉錄需要Ras 依賴的Raf-1/MAPKK/ERK 激活。也有數據表明Ras/Raf-1/MEK/ERK/IKKab 和NF-kB 通路的激活是超聲誘導前成骨細胞所必需的[8]。

1.3 MAPK/ERK表達及調控 MAPKs由一系列高度同源的蛋白激酶組成，主要是ERK、c-Jun 氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)/應激激活蛋白激 酶(stress-Activated protein kinase，SAPK)、p38 和ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶(bigmitogen-Activated protein kinase 1，BMK1)四個家族成員[23]。MAPK信號通路與破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成密切相關。體外細胞研究表明，間歇機械力和10%的周期性張力可激活人PDLCs (hPDLCs)中ERK1/2和p38mapk信號通路[24]。RasGTP 酶可介導細胞外有絲分裂信號引起級聯激活[25]，MAPK 激酶(MAPK-kinase kinase，MKKK)受有絲分裂原刺激磷酸化，激活MAPK 激酶(MAPK kinase)，MKK 進一步磷酸化，激活MAPK，即按照三級激酶級聯方式傳遞信號，使其轉入細胞核內活化，進而參與細胞免疫炎癥反應、增殖、分化[26]。大量研究表明，機械力在牙周組織中啟動MAPK信號通路，在MAPK信號中，ERK1/2是調節細胞存活、分化和增殖的最顯著的激酶，而且ERK1/2信號還被證明參與牙根形成和再生過程中的細胞增殖和分化[27]。機械應力刺激使得骨髓間充質干細胞中的ERK1/2-Runx2細胞內途徑激活，并介導這些細胞分化為骨形成成骨細胞。通過ERK1/2、JNK或p38選擇性激活MAPK細胞內信號通路，特別是p38級聯，上調成骨細胞產生炎性細胞因子和RANKL，從而啟動破骨細胞生成并促進骨重塑，進而促進正畸牙槽骨改建[28]。牙周膜干細胞具有骨形成能力，用于治療牙周炎等疾病，當與誘導成骨分化的蛋白質結合使用時，它們的治療潛力增加。例如，骨形態發生蛋白-9(BMP9)被發現具有強大的成骨活性。骨生成標記物的水平，如Runt 相關轉錄因子2(Runx2)、堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)以及礦化能力被測量。結果表明，骨形態發生蛋白9 促進了牙周膜干細胞的骨形成。在其他實驗中，分別作為p38 和ERK1/2 抑制劑的SB203580 和PD98059 被用來確定這些激酶是否參與成骨分化過程。由此得到的蛋白表達譜和成骨標記揭示了絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路可能在BMP9 誘導的成骨分化過程中起重要作用[29]。有研究證實ERK1/2和p38 的mRNA 表達水平在正畸牙周組織和hPDLCs離體牙周組織中被上調并正調控成骨相關基因的表達水平，ERK1/2和p38mapk通路與正畸牙周組織重塑密切相關[30]。這些發現有助于進一步研究正畸牙移動后牙周組織中潛在的分子機制，以及靶向ERK1/2 和p38mapk信號通路的藥物的開發[24]。

2 Ras-Raf-MAPK/ERK 在正畸牙周組織改建中的表達及調控

機械應力對于成骨細胞活性的調節對牙周重建具有重要意義，在22 個絲裂原活化蛋白激酶(MAP3Ks)中，確定了A-Raf 和C-Raf 為機械牽張活化ERK 通路的上游信號分子[31]。在骨髓間充質干細胞中，機械誘導的菌株激活了MAPK信號通路的成員分子ERK 1/2，反過來，ERK 1/2通路激活成骨基因表達的關鍵調節因子即Runx 2轉錄因子[32]，使成骨前體細胞分化和成熟為成骨細胞。MAPK的胞內信號通路對成骨細胞產生炎性細胞因子和RANKL起上調作用，從而啟動破骨細胞的生成和促進骨的重塑即牙周組織改建。通過ERK 1/2、MAPK細胞內信號通路的選擇性激活取決于組織應變的大小，而在正畸治療中，組織應變的大小取決于所施加的正畸力的特性[28]。機械應力刺激增加ALP 活性、Ⅰ型膠原表達、ATP 和Ca2+釋放，促進成骨分化[33]。研究表明，Ca2+、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)等可以激活Ras-Raf-MAPK/ERK 信號通路，從而介導細胞反應[25]。1個G蛋白偶聯蛋白Ras、3個蛋白激酶Raf-MEK-ERK可以組成Ras-Raf-MAPK/ERK信號通路。

位于成骨細胞上的AT1R可能觸發活性氧(ROS)，影響RAS，進而影響細胞外信號調節激酶(ERK)和p38促絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，兩者均調節NF-κB、導致骨鈣蛋白(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)、IL-1、IL-6、TNF-α、MMP 和RANKL 等各種成骨相關因子的產生[34]，ERK 和p38 MAPK 能促進張應力誘導的成骨分化相關基因的表達[35]。人們普遍認為，成骨調控與多種信號通路有關，是一個復雜的過程[32]。正畸牙槽骨重塑中成骨細胞和破骨細胞中hPDLCs 發揮著重要作用[36]。機械應力通過激活MAPK 信號轉導通路和Ras/Raf依賴的ERK1/2激活來調節Runx2的激活，從而促進成骨細胞的分化，而不依賴于p38 MAPK信號[16]。力學信號轉導的重要途徑是MAPK通路，而力學信號轉化為生物學信號是整合素通過MAPK通路向細胞核傳遞。整合素激活后，Runx2的轉錄活性升高，力學信號通過MAPK信號通路使ERK1/2同Runx2結合，進一步使Runx2磷酸化，從而調控成骨細胞分化[37]。整合素受體是機械轉導的引發劑，整合素-FAK-Ras-MAPK信號級聯可能密切參與成骨細胞的機械轉導[38]。應用RAS抑制劑不止抑制了p38MAPK，而且還抑制了在施加張力時PLF(成纖維細胞)中p-ERK 的增加，這表明RAS 抑制劑可能影響正畸牙槽骨改建速度。研究發現FAK 信號可與ERK-ELK1 和ERK-c-Fos 作為下游效應物相互影響，在PLF中起著至關重要的作用。通過對PLF施加張力時，Ras-p38 MAPK信號被活化，從而上調p21，而PLF 感應機械力的能力進一步影響正畸牙的移動速度[39]。

最近的研究表明，微小基因RNA21 (miRNA21)能夠通過激活MAPK信號通路，促使ERK磷酸化，進一步使RANKL高表達，提升小鼠正畸牙齒移動速度[40]。LI等[41]認為，轉化生長因子TGF-β3可能激活p38 MAPK途徑，促進hPDLSCs的成骨分化。有研究證明通過弱激光照射后誘導MAPK/ERK1/2 的磷酸化，通過MAPK/ ERK 信號傳導增加成骨細胞分裂和遷移，改善骨組織的再生，促進了正畸牙張力側牙周膜細胞的成骨分化，進而加速牙槽骨的改建[42]。此外，有文獻報道，在周期性牽張力(cyclic stretch，CS)作用下人牙周膜細胞中的p-ERK表達增加，提示周期性牽張力誘導牙周膜細胞中MAPK/ERK信號通路的活化，促進牙周膜細胞成骨分化以及MMP-1、MMP-2的表達[43]。孫瓊等[44]認為，當牙周膜干細胞中PELP1蛋白呈高表達時，Ras下游激酶c-Raf 和MEK 被激活，可通過Ras-Raf-MAPK/ERK信號通路影響牙周膜細胞成骨分化能力。許多研究表明，ERK1/2 和p38MAPK 參與了機械刺激誘導的成骨分化，流體剪切應力(FSS)在15～30 min 內迅速激活ERK1/2 和p38，提示MAPK 通路的激活是FSS 刺激hPDLCs的早期事件[30]。宋京等[45]在體外培養牙周膜細胞，建立力學刺激模型，加力組的p-ERK1/2蛋白水平比對照組明顯升高(P＜0.05)，其中在加力1 h和3 h達到最高(P＜0.01)，Runx2蛋白水平在加力3 h和6 h時明顯升高(P＜0.01)。這表明，在周期性牽張力作用下，牙周膜成纖維細胞內ERK1/2 通路可以被激活，進而調控牙周膜細胞的成骨分化。另外有文獻證明，MAPK-ERK途徑可由TGF-β激活，該途徑上調泛素連接酶SMURF1 的表達，抑制成骨細胞分化，并減少成骨蛋白的存在。ERK1/2 抑制劑使骨形態發生蛋白BMP-2成骨活性的增強表明，它可能在骨折修復中具有促進成骨的潛在臨床實用性[46]。

3 展望

近年來，Ras-Raf-MAPK/ERK 信號通路已被證實與正畸治療中牙周組織的改建密切相關，該通路活化后可促進成骨細胞和破骨細胞的分化與增殖，綜上所述，在各種不同的外界因素刺激下，不同大小的力，作用時間和頻率不同，激發的MAPK通路及作用也會不同，成骨分化標志物的表達也會不盡相同。因此，對成骨細胞及破骨細胞分化增殖和所涉及的Ras-Raf-MAPK/ERK信號通路作用機制的深入研究可以幫助臨床醫師選擇正確而有效的治療方法。但正畸牙槽骨改建涉及多因素的調控，其中Ras、Raf 活性的確切影響及MAPK 對hPDL 中生長因子產生的作用尚未清楚[47]，因此進一步研究在外界因素的刺激下牙周膜細胞的機械反應和所涉及的Ras-Raf-MAPK/ERK 信號通路細胞間的轉導關系，進一步探討牙周組織改建的具體機制，以期為臨床提供理論依據，可能有助于解決正畸治療中的挑戰，實現在縮短矯治療程的同時又不影響牙齒移動張力側和壓力側的動態平衡過程。