環境DNA技術在河流生態系統中的應用研究進展

陶 潔，曹 陽，左其亭

(1.鄭州大學水利科學與工程學院，河南 鄭州 450001；2.鄭州市水資源與水環境重點實驗室,河南 鄭州 450001；3.河南省地下水污染防治與修復重點實驗室，河南 鄭州 450001;4.鄭州大學黃河生態保護與區域協調發展研究院，河南 鄭州 450001)

水利水電工程建設運行、污染物超標排放、水生生物過度捕撈等一系列人類活動[1]，改變了原有河流生態系統的生態平衡和水生棲息環境，導致河流生物多樣性減少，影響了河流生態系統的健康。河流生物多樣性是反應河流健康的重要指標[2]，其傳統檢測方法，如網捕、電釣等都是通過在調查點捕獲樣本或者制作成標本再進行鑒定，不但費時費力，對檢測物種也不友好。

基于這種情況，環境DNA(environmental DNA， eDNA)技術應運而生，被認為能夠有效彌補傳統技術的缺陷。eDNA是從生物體(包括皮膚、黏液、鱗屑、尿液、糞便、唾液、配子或遺體等)脫落的細胞內或細胞外的，并懸浮在環境基質(如水、土壤或空氣)中的DNA[3-7]。eDNA的產生依賴于生物體的生物量、年齡、攝食活動以及生理、生活史和空間使用[4]，而eDNA技術可以從環境基質中捕獲產生的DNA，并將其進行保存、提取、擴增和測序[8]，進而根據測序結果，判斷物種種屬。這種新型的檢測方法已被證明在生物檢測中的巨大潛力，經過10多年的發展，它在檢測入侵物種、瀕危或受到威脅的本土物種以及其他難以用傳統方法檢測的低密度的物種等方面都有可靠的應用，也被廣泛應用在物種分布和豐度的估測等多個領域[9-10]。

由于其高效性、準確性和低成本性，eDNA技術在獲取河流的物種信息和解決河流生態相關問題等方面起到了巨大的作用。本文通過查詢河流生態系統領域與eDNA技術相關的文獻，采用文獻計量分析方法對發文狀況、主要研究領域、未來研究熱點等進行統計分析，綜合闡述了eDNA技術在河流生態系統中的應用研究現狀，并提出未來重點研究方向。

1 檢索方法與結果

1.1 檢索方法與數據來源

CiteSpace文獻數據可視化軟件是一款文獻計量分析軟件，可以對檢索到的論文中的作者、關鍵詞、標題、摘要和被引文獻等進行分析，能有效地尋找到研究領域的熱點和發展前沿[11]。本文采用該軟件對關鍵詞的聚類圖、頻次以及突現狀況進行分析。

研究數據來自中國知網(CNKI)和科睿唯安信息服務公司下屬的SCI-Expanded數據庫。自1991年起，SCI出版物都增加了摘要，因此在主題搜索中，可以同時從標題、摘要和關鍵詞中收集相關信息并通過分析標題、摘要和關鍵詞可以得到合理詳細的主題重點。在數據收集的過程中，為了確保原始數據的準確性和全面性，需要進行檢索方法的優化和檢索策略的調整，并排除無關的文獻。在知網數據庫中以“環境DNA”“eDNA”為主題進行高級檢索，主題詞之間以“或”相連，檢索完后，選擇“中文文獻”來限定范圍；在SCI-Expanded數據庫中以“environmental DNA”“eDNA”為主題進行檢索，主題詞之間以“or”相連；由于eDNA技術是Ficetola等[3]于2008年首次應用到水生生物檢測中的，故將中外數據庫的檢索時間跨度均設為“2008—2019年”。

1.2 結果分析

1.2.1論文發表數量和趨勢

對獲取文獻進行整理和精準匹配，同時從標題、摘要和關鍵詞中搜集信息，去除與河流生態系統無關文獻，知網檢索到的國外作者發文歸到國外，SCI-Expanded數據庫中檢索到的國內作者發文歸到國內，最終檢索得到46篇國內作者發表的文獻和758篇國外作者發表的文獻。對國內外發文量進行年度統計(圖1)，國外eDNA發文數量在2008—2013年呈平穩趨勢，2014年之后逐年穩步提升；國內eDNA的發文量的趨勢和國外相同，雖然發文量很低，但近幾年來呈明顯上升趨勢。2013年之后該領域受到了學術界的廣泛關注，在一定程度上與其檢測監測的優越性有關。

圖1 eDNA的發文量

1.2.2關鍵詞頻次分析

圖2為CiteSpace關鍵詞共現網絡圖，關鍵詞出現次數越多則字體越大。除了“環境DNA”和“environmental DNA”“eDNA”這些關鍵詞的不同之外，國內eDNA技術研究過程中出現頻次較高的關鍵詞有：生物多樣性(或物種多樣性)、水生生物、生物監測(或物種監測)、水生態系統、coi(指的是線粒體DNA上的一段蛋白質編碼基因，主要被生物科學領域用作系統發育研究或DNA條形碼研究)等；國外的有：diversity(多樣性)、conservation(保護)、temperature(溫度)、abundance(豐度)、metabarcoding(宏條形碼)等。

(a) 國內發文

(b) 國外發文

網絡共現圖中存在一些節點，代表被分析的對象，其中頻次越高則節點就越大，節點之間的連線表示共現關系，連線越粗表示共現關系越強。國內(圖2(a))由于在此方面研究的文獻較少，所以節點的大小不夠明顯，但從國內外發文關鍵詞頻次(表1和表2)可知，國內外在研究方向上基本相同，主要集中在生物多樣性和物種入侵方面，但是與國內相比，國外的研究呈現更加多元化的趨勢，不僅僅局限于eDNA在生物本身的應用，還關注其影響因素、提取方法和PCR技術(又名聚合酶鏈式反應，是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術)等，具體包括：光照、時間和溫度等對eDNA濃度的影響機理研究，為防止樣品污染而改進提取方法的研究，能帶來測序速度和準確率提高的PCR技術更新研究。

表1 國內發文前15個關鍵詞出現頻次

1.2.3關鍵詞突現分析

通過對關鍵詞的突現性分析，可以了解不同時間階段eDNA技術的應用研究情況。表3和表4顯示了關鍵詞突變的出現時間以及持續時間。2014—2015年是國內關于eDNA技術研究的開始階段，主要聚焦在河流生態方面，隨著研究的深入逐漸過渡到微觀領域對eDNA的測序技術方面，這對水生生物和物種監測研究成為2018—2019年的研究熱點起到了一定的推動作用。相比國內，國外eDNA技術的研究要早許多，也不局限于物種監測方面，并且逐漸從eDNA技術本身過渡到對河流環境中DNA的運輸、產生和降解及其敏感性的研究。只有深入了解外在因素對eDNA的影響機理，才能通過eDNA技術得到更加精確的檢測結果。

表2 國外發文前15個關鍵詞出現頻次

表3 2008—2019年國內引文爆發最強的7個關鍵詞突現點

表4 2008—2019年國外引文爆發最強的15個關鍵詞突現點

2 研究進展

2.1 eDNA研究技術手段

eDNA在河流生態系統研究中最常用的兩種技術是條形碼(barcoding)和宏條形碼(metabarcoding)技術。條形碼和宏條形碼的主要區別在于：條形碼主要用特異性引物來對單個DNA片段進行測序，主要針對單一物種[12-14]，檢測精度較高；宏條形碼則是使用通用引物同時檢測來自多個營養水平的各種物種的數百萬個DNA片段，主要針對復雜群落[15-16]。DNA條形碼對于探測入侵的、稀有的和低密度的物種尤其有用，即使是在研究者難以進入的棲息地，也可以繪制它們的棲息地和物種分布圖并且設計相應的保護策略。eDNA宏條形碼也已經成功地用于描述過去和現在的生物多樣性模式以及研究珍稀瀕危物種的產卵生態[17-19]和監測生態系統健康和動態[20-21]。

2.2 eDNA技術應用研究的主要內容

2.2.1物種檢測和監測

自從在法國天然池塘水體中成功提取出了美國牛蛙(一種原產于北美的入侵兩棲物種)的eDNA[3]，eDNA技術便提高了研究者們對河流生態系統研究的興趣，并被廣泛應用于入侵物種檢測、珍稀物種監測等領域[22-23]，這些應用研究證明了eDNA技術有著傳統調查方法所缺少的靈敏度、精度和效率。Valentini等[24]利用eDNA技術對骨魚和兩棲動物群體進行檢測，得出的結果為該技術和傳統方法相比，檢出率相同或更高且效率更高。吳昀晟等[25]利用eDNA技術對長江流域的江豚進行監測；Shelton等[26]通過eDNA的濃度對美國華盛頓州斯卡吉特灣瀕危的大鱗大馬哈魚進行物種監測；Jo等[27]通過eDNA技術對日本兵庫縣東南部的3個外來魚類和3個瀕危的本土魚類進行不同季節的分布檢測與監測。以上應用對入侵物種的早期發現、瀕危物種管理與監測和瀕危物種等的有效保護提供了很大幫助。

eDNA技術解決了傳統技術在檢測和監測入侵、未知和瀕危物種時費時、費力等問題，對物種分布的長期監測、珍稀瀕危物種的保護和入侵物種的預防以及政府政策的制定都能起到很大的作用。

2.2.2物種生物量估測

準確了解物種在河流環境中的生物量有助于維持河流生態系統的健康。研究表明，eDNA濃度與環境中的生物量正相關，因此，eDNA濃度可以在一定程度上反映物種的生物量[28-30]。Takahara等[31]利用eDNA技術來檢測實驗室和池塘試驗以及淡水湖泊實地調查的eDNA濃度，對比進行鯉魚的生物量估測，得出eDNA濃度能反映目標物種生物量，并可據此推測自然環境中的鯉魚分布情況。Dougherty等[32]利用傳統誘捕小龍蝦的方法和eDNA技術對美國中西部地區內陸湖中入侵的銹斑小龍蝦(Orconectesrusticus)進行了監測及相對豐度估測，結果表明eDNA技術檢測物種的成功率隨該物種相對豐度的增加而增加。Doi等[33]在日本瀨戶內海西部Suonada灣的Saba河進行了eDNA試驗,得出eDNA濃度與香魚的生物量呈顯著正相關關系。

雖然能夠通過eDNA技術檢測eDNA濃度來快速評估物種的生物量，但是通過eDNA濃度對生物量的準確估計仍然具有挑戰性，并取決于多種因素，如個體釋放到水中的DNA數量、河流的運輸率和eDNA隨時間和溫度的穩定性等[34]。此外，行為和季節也會影響物種的檢測和利用eDNA濃度對豐度的估測。因此，在應用定量eDNA方法之前，需要對這些誤差進行量化。

2.2.3生物產卵繁殖調查

掌握河流水生生物的繁殖活動對于物種多樣性的保護和管理非常重要。eDNA技術可以通過檢測水體中eDNA的濃度分布來確定生物產卵的空間范圍。Bylemans等[17]通過eDNA技術對瀕危的澳洲麥氏鱸進行產卵活動監測。Maruyama等[18]使用qPCR技術(實時熒光定量PCR技術)對日本受威脅的本地三唇馬口魚的繁殖遷移進行了非侵入性監測。Antognazza等[19]以qPCR技術為基礎，提出了鯡魚(Alosa)的eDNA檢測方法，并在英格蘭西部Teme河上進行了檢測，確定了鯡魚產卵期的持續時間和空間分布范圍，并對鯡魚的空間分布進行了評估。

更有研究者發現繁殖時期eDNA在水體中的濃度會顯著增加，并且只在一定的空間范圍內顯著變化。基于此，了解物種在何時何地發生繁殖行為，明確繁殖期與非繁殖期eDNA濃度與生物資源量的定量關系，可以更精確地了解其如何影響生物量的預測。

2.2.4生物多樣性檢測

在全球氣候變化和人類活動的影響下，生物多樣性正在快速地喪失，全球正經歷第六次生物多樣性危機[35]。保護生物多樣性是一項全球性的挑戰，它需要大量不同時空尺度上的物種分布和數量數據。傳統方法調查生物多樣性往往存在效率低下、生物損傷、環境破壞等缺點，eDNA技術提供了一種新的方法來評估生物多樣性，只需要少量的水樣便能可靠地檢測出水環境中的目標生物，包括入侵的、瀕危的和當地的物種[36-40]。Lacoursière-Roussel等[41]通過eDNA技術檢測北極兩個港口采集到的水樣，成功鑒定出了181個物種。Jo等[42]進行的魚類多樣性調查顯示，eDNA技術檢測的平均種數為19(±4.4)種，略高于常規調查得到的10(±4.8)種，但在對韓國特有物種和外來物種的鑒定中顯示，通用引物(Mi-Fish引物集)并不適用，此外，一些常規方法捕獲的瀕危物種也沒有被eDNA技術檢測到，所以需要對通用引物進行開發或補充，以便eDNA技術能識別更多的韓國本地淡水魚。在eDNA技術的支持下，分析生物多樣性也變得更加便捷，但需要更豐富的引物集來和DNA序列進行配對，才能識別更多的物種。

生物多樣性檢測依賴于精確快速的基因測序技術，目前它已經發展到第三代。第三代基因測序技術[43-44]采用單分子讀取技術，并且不需要進行PCR擴增處理，具有更高的通量和測序效率，操作過程更簡便，測序速度更快，讀長更長，可達幾千個堿基，可進一步節省測序成本，同時克服了傳統檢測分析中錯誤頻率較高的問題，這對于提高eDNA技術在物種檢測方面的檢出率有很大幫助。

此外，eDNA技術在河流水質評價和水污染評價[45-46]、病原體的檢測[47-49]等方面也有應用，如eDNA序列的種類、濃度大小及變化速率、濃度分布等可以反映出指示生物的多樣性和物種豐度及其變化、指示物種的群落分布及結構變化、食物鏈食物網的能量流動、動植物的相互作用以及其在維持生態系統功能和提供生態系統服務中的作用等[50-51]；在病原體檢測方面，eDNA技術可監測河流環境中物種攜帶的病原體，這能起到很好的疾病預防作用。

3 研究展望

eDNA技術是集高效、精準和標準化為一體的新一代生物物種和多樣性檢測和監測工具，相較于傳統調查方法具有明顯優勢，隨著第三代基因測序技術的發展，eDNA技術檢測和監測結果更加精確，在河流生態環境和物種保護中也發揮著更廣泛的作用。然而作為一種新技術，未來eDNA技術在河流生態系統中的應用研究應著重在以下幾個方面：

a.開展生物及非生物因素對eDNA濃度的影響機理研究。雖然eDNA技術在物種生物量估測和生物多樣性分析等方面具有巨大的潛力，但因為生物及非生物因素的影響，該技術大面積應用還存在一定的局限性。例如，eDNA的產生率和降解率直接影響著河流中的eDNA濃度，eDNA的持久性、轉移和沉降等間接影響著河流中的eDNA濃度，所以未來應該建立eDNA濃度與生物、非生物因子之間的量化關系，以有效提高eDNA定量檢測結果的準確性。

b.因地制宜地豐富公共數據庫，開發設計適合當地的通用引物。雖然通用引物能同時檢測出許多物種，但由于物種的生理特征和環境因素的不同，會導致通用引物的檢測出現檢測不出或結果錯誤的狀況，且目前對河流生態系統的群體質量信息掌握不夠。因此加強通用引物設計和數據庫擴展對檢測當地河流生物群體信息、生物多樣性、物種入侵以及制定物種保護政策非常重要。

c.開展eDNA采樣、保存、運輸、提取、分析等全過程標準研究和制定。統一的標準是確保樣本研究過程和結果具有可對比性的重要條件。

d.將傳統調查方法和eDNA技術結合。eDNA技術作為新興技術，還有著其不完善的地方，而傳統調查方法雖然缺點明顯，但是它的調查過程更直觀、識別率更高，并且不為地域所限，將兩者有效結合，可以互相彌補，顯著提升河流物種檢測和監測精度。但是在具體使用過程中如何結合需要進一步探索。

e.拓展eDNA技術的應用研究范圍。除了應用在河流生物入侵檢測和監測等方面，未來eDNA技術應加強在食物網、檢測物種體內病原體、能量流動等方面的應用研究，便于更全面地了解河流生態系統進程，掌握河流健康動態。