Aβ蛋白引發阿爾茲海默癥發病機制及檢測方法的研究進展

劉保宏

大連大學，遼寧省大連市 116622

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是臨床老年智力障礙中最常見的類型，是一種不可逆的神經退行性的疾病，隨著老齡人口的逐年增多，其發病率也在逐年升高。AD的病因仍不明確，因此對其臨床的早期診斷仍具有一定的困難。目前被大家廣泛認可的β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ-proein，Aβ)級聯假說認為Aβ 蛋白代謝失衡、沉積形成老年斑是誘發AD 的重要因素[1]。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)經過β和γ分泌酶的蛋白水解作用生成的含有39～43個氨基酸的多肽。當其在腦中的代謝發生失衡時，聚集和形成的低聚物和纖維體會沉積于腦中，即使少量也具有很強的神經毒性，可引起腦部病變[2]。因此針對Aβ蛋白的檢測對于AD的診斷、干預、治療有重要意義。

1 Aβ蛋白引發AD的機制

Aβ蛋白引發AD的機制主要表現為Aβ蛋白代謝失衡后引發氧化應激、神經炎癥、海馬區長時程增強抑制以及 Aβ降解酶活性受損等反應，以上因素均可誘導AD發病或加重病情。

1.1 Aβ蛋白引發機體氧化應激 氧化應激是由于氧化劑與抗氧化劑之間的作用不平衡，導致氧化還原信號和相關氧化分子被破壞，使腦部在氧化還原反應中更傾向于氧化[3]。然而過量的氧化應激代謝產物活性氧(ROS)將導致機體內生物大分子如脂質、蛋白質、DNA 及RNA 的過度氧化損傷[4]。同時相關研究表明，Aβ及其前體APP的N端的金屬結合域中含有銅和鋅等金屬離子的高親和力結合位點，銅離子能高效介導羥基自由基的氧化，因此當人體內Aβ蛋白大量異常沉積時，引起老年斑中大量的銅離子聚集參與氧化，導致AD患者腦中氧化應激反應增加，進一步加劇了腦部損傷使病情加速進展[5]。

根據研究證實大量的ROS會反作用促進Aβ蛋白的沉積[6]，且氧化應激相關氧化標記物如丙二醛(MDA)、4-羥基壬烯醛(4-HNE) 可以增強神經細胞膜上鈣離子通道的開放，加速鈣離子的內流，神經細胞興奮性增強,使得蛋白激酶過度的活化，促使Tau蛋白的過度磷酸化，加重病情[7-8]。

同時近期研究表明Aβ蛋白的聚集可影響神經細胞的線粒體，從而導致線粒體的損傷[9]。過度的氧化應激不僅能阻礙線粒體電子的傳遞，同時會造成線粒體DNA和相關突觸的損傷[10]。當線粒體損傷達到一定程度時會進一步加速相關神經細胞的凋亡，使病情惡化[11]。

1.2 Aβ蛋白刺激引發神經炎癥 沉積的Aβ蛋白本身作為一種炎癥刺激因子直接刺激神經細胞產生炎癥因子，導致神經炎癥[12]。同時Aβ蛋白能夠活化老年斑周圍的小膠質細胞和星形膠質細胞，引起TNFα或IL-1-β等促炎性細胞因子的釋放[13]，長時間的神經炎癥會導致神經突觸的功能障礙加速神經元的變性，加劇腦部損傷引起病變[14]。Aβ蛋白沉積可以誘導Toll樣受體4(TLR4)的活化，使神經炎癥得到進一步發展[15]。同時有研究表明，小膠質細胞被誘導激活而釋放多種炎癥因子，其中部分因子能夠降低Aβ清除效率，如胰島素降解酶等，在炎癥的基礎上進一步加劇了Aβ蛋白的沉積[16]。隨著炎癥的發生，可溶性的Aβ蛋白會促進炎癥相關的趨化因子(C-X-C基序)配體中(CXCL)8、CCL2和CCL3的水平的增加，這些配體會引發Aβ蛋白認知障礙，使得Aβ的清除障礙加劇，病情加重[17]。

1.3 Aβ蛋白對海馬區長時程增強抑制 目前，有研究明確海馬區長時程增強(LTP)與神經元突觸的可塑性直接相關，而神經元突觸的可塑性又與學習記憶能力息息相關，可以通過測定海馬區長時程增強是否被抑制來反映患者學習記憶能力衰退程度[18]。經證實當Aβ蛋白沉積時，會影響作用于海馬區長時程增強(LTP)效應的蛋白質從而抑制其誘導過程，減低患者的學習記憶能力[19]。當海馬區的Aβ蛋白沉淀并進入CA1區時，會誘導70%神經元的丟失和錐體神經元的變形，加重海馬區的長時程增強抑制，導致AD患者失憶、意識障礙等癥狀更嚴重[20]。更有相關研究證明，Aβ蛋白可以在分子和突觸水平上改變海馬體CA1區的G蛋白門控的內向整流鉀通道(GirK)通道，抑制其誘導而降低了海馬區長時程增強的效應，對AD患者的認知水平造成損害。除沉積的Aβ蛋白外，可溶性的Aβ寡聚體也可以激活NR2B基因和N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA受體)來抑制LTP。

1.4 Aβ降解酶活性受損 Aβ蛋白的沉積是由于其代謝失衡，而Aβ蛋白的降解酶的活性受損和喪失在代謝失衡中發揮著重要的作用，目前研究表明能夠識別和分解Aβ蛋白單體和寡聚體的酶主要是腦啡肽酶(NEP)和胰島素降解酶 (IDE)。NEP是一種膜結合的中性鋅內肽酶，可在被激活的小膠質和星形膠質細胞中高度表達，當神經細胞激活過度或細胞損傷缺失時，則會引起NEP的分泌相對或絕對不足，造成Aβ蛋白的沉積。IDE則作為一種胞質蛋白酶發揮降解Aβ的作用，其分泌本身與年齡呈負相關，隨著年齡的增加，其分泌的量降解Aβ蛋白的能力不足以和生成能力保持平衡，因而老年人中阿爾茲海默癥發病更為常見。部分相關研究也表示，當人體尤其是腦中膽固醇的水平升高時，可通過消耗線粒體中的谷胱甘肽(mGSH)，來刺激氧化應激，而NEP、IDE均可作為氧化的底物被消耗導致含量減少，引起Aβ的降解障礙，導致AD發病。

2 Aβ蛋白及其相關產物的檢測方法

2.1 Aβ蛋白檢測 目前認為腦中的淀粉樣變性已經成為AD的決定性特征，因此β-淀粉樣蛋白的聚集被作為診斷的標準，并且研究表明AD患者腦中和血液中Aβ蛋白的水平與正常人比較存在顯著差異。關于腦中Aβ蛋白的沉積，通常利用以11C-匹茲堡復合物B和18F為示蹤劑的正電子發射體層成像(PET)來進行測定，是目前臨床確診AD和預測其轉歸的重要手段。近期在針對血清中可溶性Aβ低聚物的測定研究中，發現一種利用Aβ蛋白N端的表位重疊抗體捕獲和檢測血漿中Aβ多聚體和寡聚體的技術：多聚體檢測系統(MDS)，是一個特異性較強的新型酶聯免疫吸附測定法，對于輔助AD的早期診斷具有重要意義。除針對Aβ蛋白的定量測量外，Aβ蛋白二級結構的變化也是AD患者血液中重要的生物標志物，Nabers等研究表明一種基于抗體免疫的紅外傳感器，可觀察Aβ肽二級結構的變化，且靈敏性和特異性均較好，能為AD診斷提供良好的證據。

2.2 Aβ蛋白相關基因檢測 目前臨床的基因研究中普遍認為，載脂蛋白E(ApoE)基因的多態性是老年癡呆典型的遺傳易感因素，ApoE可從多種機制引發AD。其中ApoE4基因作用最為顯著，在抑制Aβ蛋白分解的同時增加其在老年斑內的神經毒性。ApoE基因可利用PCR反應來進行多態性分析，并使用基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術(SNaPshot反應)來確定其位點的遺傳變異情況。對于ApoE的基因檢測可間接反映Aβ蛋白的沉積現象，使得AD的早期診斷成為可能。

IDE基因是否表達與Aβ蛋白的沉積聯系十分密切， IDE的蛋白質水平與Aβ蛋白的沉淀有定量指標的作用，可利用蛋白質印跡技術(Western blot)來進行定量分析，對判斷AD患者病情的嚴重性具有重要意義。

除此之外還有β淀粉狀蛋白前體蛋白(突變APP)、早老素1(PSEN1)、早老素2(PSEN2)等顯性遺傳基因均會增加AD發病的風險，可利用基因測序技術來進行早期的預測，對評價AD發病風險有重大意義。

2.3 血清中神經炎性介質的檢測 經研究表明與Aβ沉積密切相關的神經炎性因子有TNFα和IL-1-β，除了常規的免疫組織化學檢測方法外，還可利用免疫熒光顯微鏡技術、共聚焦顯微鏡技術對該神經炎性介質進行檢測。顯微鏡觀察腦組織切片反映小膠質細胞和星形膠質細胞的損傷程度與炎性細胞因子含量成正相關，因此檢測血清或腦脊液中TNFα和IL-1-β的基因表達水平對AD患者治療和病情進展具有指導作用。根據Startin等的研究表明血清中的TNFα和IL-1-β也可用靈敏度是ELISA 1 000倍左右的超靈敏Simoa免疫測定法來進行測定，能極大程度提高細胞因子的準確性，有利于判斷神經炎癥的嚴重程度。

2.4 氧化應激相關的測定 腦脊液中Cu離子的失代償會促進氧化應激，因此可通過測定腦脊液中Cu離子的濃度來反映氧化應激發生的程度。近年來McQuade等發明出一種Cu配合物的熒光探針技術，可與腦脊液中的Cu高特異性結合，使腦脊液中Cu離子濃度變化成像成為可能，同時也使觀察Cu離子變化程度來監測腦中氧化應激的程度，來判斷腦部損傷成為可能。活性氧(ROS)作為氧化應激的產物，Tang等利用與活性氧OH自由基發生反應的熒光分子探針技術對活體腦進行檢測、成像分析，使得直觀觀察出活體腦中ROS的濃度成為可能 。Connolly等利用原代神經元培養技術復制離體且生物性狀相同的腦神經元，使用四甲基羅丹明甲酯(TMRM)作為分子探針，來檢測離體神經元線粒體膜電位的變化情況，膜電位變化能極好地反映出線粒體膜功能損傷的嚴重程度與活性氧含量的相關性。活性氧濃度的測定對于研判AD病情的嚴重程度具有重要價值。

3 Aβ蛋白相關檢測方法仍存在的問題

3.1 取材問題 對于AD患者臨床診斷，主要是依據對于腦脊液的介入性測定Aβ蛋白表型來進行確診。雖準確率可達80%～90%，但腦脊液的采取會對患者造成創傷，對老年體質較弱患者具有相當的限制性，不適于臨床推廣。

3.2 檢測方法問題 目前Aβ沉淀的檢測多利用PET、MRI等影像學技術。據研究，成像技術對于Aβ蛋白異常積累的檢測有一定的滯后性，顯示結果明顯慢于腦脊液(CSF)分析。同時11C-匹茲堡復合物B用作標記物其半衰期較短，導致檢測過程成本高。且PET的放射性示蹤劑和熒光分子探針中的放射性物質，會造成腦中的放射性同位素的暴露，造成腦部細胞不同程度的損傷。而多聚體檢測系統(MDS)、超靈敏Simoa免疫測定法、抗體免疫的紅外傳感器等技術雖然具有較高的靈敏度和特異性，但時間成本、技術成本和技能要求也更高，因此具有相當的局限性，不適于臨床的普及。同時對于ApoE基因的檢測由于RT-PCT在ApoE變體的時候會導致錯誤的結果，可能出現一定程度的誤差。

3.3 檢測結果的問題 對于Aβ蛋白的PET檢測由于生物標記物的類型不同、標準結果參考范圍和統計方法的差距導致了檢測結果依舊存在不確定性。研究表明利用ELISA方法測定血清相關的炎性介質時，由于其量少且易受機體新陳代謝、炎性細胞及分泌物的影響所以會造成測量誤差較大、診斷標準不明確等問題。同時由于Aβ沉積是多基因的作用結果，單基因ApoE的測定僅能為確診提供一定的支持條件，并不能對患者進行直接確診。

綜上所述，腦脊液相關檢測存在相當的局限性，而血清中Aβ蛋白生物標志物的檢測和相關基因測序在未來AD的臨床檢測中表現出明顯優勢。目前國內外已研究出很多Aβ蛋白相關生物標志物和相關基因，而明確其與AD發病率相關性的研究很少。因此明確其相關性后，研究出針對生物標記物高效、高靈敏度、廉價的檢測方法對于AD早期的篩查和診斷有至關重要的作用。