茶樹原生質(zhì)體制備體系的研究進展

葉晶晶 趙 東 梁月榮 陸建良 鄭新強

(浙江大學(xué)茶學(xué)系，杭州 310058)

茶樹(Camelliasinensis(L.) O. Kuntze)特征性次生代謝產(chǎn)物豐富，屬于重要的經(jīng)濟作物[1]，目前新品種的培育仍以傳統(tǒng)的育種方式為主，育種效率低，定向育種技術(shù)薄弱。通過基因功能鑒定和克隆技術(shù)，與次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的遺傳編碼陸續(xù)被成功破譯，但茶樹的遺傳背景相對復(fù)雜，基因功能的研究明顯滯后。與傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相比，瞬時過表達/抑制為體內(nèi)基因功能分析提供了一種方便的替代方法。原生質(zhì)體可廣泛應(yīng)用于植物瞬時表達分析。基于原生質(zhì)體的表達系統(tǒng)不僅可用于酶活性測定，也可用于亞細胞定位分析，還可以用來研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和轉(zhuǎn)錄激活，而且原生質(zhì)體是克服遠緣雜交障礙、創(chuàng)新品種的重要載體[2]。

原生質(zhì)體早在1892年就由Klercker[3]通過機械法從水劍葉葉片中獲得，但一直到1960年，Cocking[4]利用酶解法從番茄根尖獲得產(chǎn)量大活力高的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體制備研究才真正開始。目前，許多模式植物和糧食作物例如煙草[5]、擬南芥[6]、玉米、小麥、水稻[7]等的原生質(zhì)體分離技術(shù)已經(jīng)非常完善，應(yīng)用領(lǐng)域在不斷拓寬。

Rona[8]于1972年利用酶解法建立了歐亞槭的原生質(zhì)體再生體系，開創(chuàng)了木本植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)先河。目前，桑樹[9]、柑橘[10]、蘋果[11]、枇杷[12]、橙[13]、中國李[14]、狗頭棗[15]、柿[16]、山杏[17]、荔枝[18]、菠蘿[19]、草莓[20]等多種園藝植物的原生質(zhì)分離、培養(yǎng)及融合等研究工作已取得重要的進展。此外，一些具有經(jīng)濟價值的木材和能源樹種，例如銀杏[21]、橡膠樹[22]、油桐[23]、日本榧[24]、國槐[25]、油棕[26]等以葉片為材料在原生質(zhì)體制備方面也有了很大的進步。

茶樹原生質(zhì)體研究起步遲而且少。中村順行[27]以茶樹新梢嫩葉和花瓣為材料分離得到原生質(zhì)體，但并未說明其細胞活性。之后的30余年間僅有一篇茶樹花粉管亞原生質(zhì)體分離的報道[28]。直到2016年楊子銀等[29]、王璐等[30]申請專利，以茶樹花瓣為材料制備得到原生質(zhì)體，并證明其具有良好的外源基因表達活性。隨后劉艷麗等[31]以茶樹品種‘鄂茶1號’的幼苗葉片為材料制備原生質(zhì)體，彭章等[32]以暗培養(yǎng)的茶樹幼嫩葉片和胚根原生質(zhì)體為材料建立了原生質(zhì)體分離體系，為茶樹體細胞雜交等細胞水平的研究提供了獲取原生質(zhì)體的方法。

但是，對茶樹原生質(zhì)體的大規(guī)模分離還不成功，以往的研究試圖從茶葉、花和胚根中分離原生質(zhì)體，但是所用材料的條件嚴重限制了茶葉原生質(zhì)體分離的可行性。了解原生質(zhì)體的制備分離鑒定體系，有助于建立茶樹的原生質(zhì)體培養(yǎng)及瞬時表達系統(tǒng)。本文依原生質(zhì)體的制備體系流程的各個環(huán)節(jié)介紹了原生質(zhì)體獲取的影響因素及研究進展，為完善茶樹原生質(zhì)體制備體系提供理論依據(jù)。

1 原生質(zhì)體制備體系

植物的原生質(zhì)體制備體系包含制備材料的選擇、原生質(zhì)體分離和原生質(zhì)體純化。

1.1 制備材料的選擇

制備材料的基因型、材料的組織類型和生理狀態(tài)是材料選擇時需要考慮的因素。現(xiàn)有植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要起始材料有幼胚[14]、幼葉[15,19]、幼根[32]、愈傷組織[10,13,16]、胚性細胞懸浮物[17-18,20,33]、雌雄配子體[34]等, 使用最多的是葉片、愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物[35]。在茶樹原生質(zhì)體制備的已有報道中，主要以葉片、花瓣為材料，且通常選擇幼嫩葉片或數(shù)周齡實生苗的葉片。

對制備起始材料進行黑暗等預(yù)處理，可能有利于酶解效率。王璐等[30]為提高酶解效果，使得酶液能充分深入植物組織中，將盛有酶解液和茶樹花瓣的培養(yǎng)皿先置于真空泵中于黑暗條件下抽真空40min～1h再進行酶解；劉艷麗等[31]在酶解前將葉片于含0.5～0.6 mol/L甘露醇的原生質(zhì)體漂洗液中靜置30 min，促使質(zhì)壁分離。此外，為了擴大材料與酶解液的接觸面積，提高酶解效率，通常會將葉片或花瓣切成寬0.5～3 mm的細條或5 mm2的小塊[27-32]。

1.2 原生質(zhì)體分離

分離原生質(zhì)體的方法主要有機械法和酶解法，現(xiàn)在最常用的是酶解法[36]。應(yīng)用最廣泛的酶有纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、崩潰酶和離析酶等。彭章等[32]研究發(fā)現(xiàn)‘福鼎大白茶’分離原生質(zhì)體的最佳酶為纖維素酶、離析酶和果膠酶，其中幼嫩葉片和胚根的三種酶組合分別是1.5%、0.1%、0.5%和1.5%、0.3%、0.5%；而‘鄂茶1號’品種的實生苗葉片分離的最適酶組合用量為1.5%纖維素酶和2.5%離析酶[31]。但不同研究中所使用的酶的種類和濃度都不同，且多為單一因素的研究，所得結(jié)果的適用性不高。

原生質(zhì)體的分離效率還與酶解溫度和時間、酶解液的pH值和轉(zhuǎn)速有關(guān)。通常木本植物的酶解溫度在室溫25 ℃左右，酶解液pH在5.6～5.8之間，茶樹原生質(zhì)體分離實驗中pH值多為5.7或5.8；為防止原生質(zhì)體機械損傷，轉(zhuǎn)速通常控制在50～100 rad/min，在茶樹已有報道中搖床轉(zhuǎn)速多為50～55 rad/min。由于分離材料的差異性，不同品種及不同類型材料的酶解時間差距較大，一般在4～18 h之間，茶樹花瓣和胚根的最佳酶解時間比較相近，為6～8 h，而葉片的酶解時間一般長于10h，有研究認為16～18 h最佳[27-32]。已有研究的酶解時間均比較長，不利于操作。理論上酶解轉(zhuǎn)速越高，酶解速度越快，酶解時間越短，但茶樹原生質(zhì)體方面的研究少，多少轉(zhuǎn)速更加適合茶樹材料的酶解尚缺乏依據(jù)。

為了防止游離出來的原生質(zhì)體破裂，酶解液中需添加穩(wěn)壓劑以維持合適的滲透壓，不同植物所需要的滲透壓有所差異，甘露醇[18]、山梨醇[16]、蔗糖[37]等均有調(diào)節(jié)滲透壓的作用，其中甘露醇最為常用，濃度在0.4～0.6M之間，最佳濃度視品種和材料類型而變化。同時，為了防止質(zhì)膜損傷，酶解一般放置在黑暗或弱光環(huán)境下進行。

此外，實驗證明在混合酶液中加入一定量的MES能穩(wěn)定酶解液pH值，而PVPP、抗壞血酸[38-39]、檸檬酸、氯化鈉[39]等可以有效減輕酶解過程中原生質(zhì)體的褐化程度。酶解液中加入1% PVPP和2mmol/L抗壞血酸后從茶樹葉片游離出來的原生質(zhì)體的褐化程度降低，呈輕微褐綠色，說明二者可以降低多酚氧化，提高原生質(zhì)體的質(zhì)量[31]。

1.3 原生質(zhì)體純化與活力檢測

經(jīng)過酶解處理后，得到的混合液中成分復(fù)雜，除了原生質(zhì)體外，還有未解離細胞、細胞或原生質(zhì)體碎片等。這些混雜物會對原生質(zhì)體造成傷害，因此需要去除雜質(zhì)，以獲得高活力的高純度原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體純化的方法主要有沉降法、漂浮法和界面法[36]。沉降法應(yīng)用最廣泛，操作方便損失少，但是純度不高[40]；漂浮法得到的原生質(zhì)體純度高，但是收率比較低[41]；界面法得到的原生質(zhì)體大小均勻一致，但是收率也比較低。已有研究中報道過應(yīng)用沉降法和界面法進行純化[29-31]。而FDA法(熒光素二乙酸)和臺盼藍染色法是最常用的檢測原生質(zhì)體活力的方法[42]。彭章等[32]采用沉降法和臺盼藍染色法分別測定產(chǎn)量和活力，明確在最適處理條件下‘福鼎大白茶’的幼嫩胚根分離產(chǎn)量可達3.2×106個·g-1，活力89%，幼嫩葉片分離產(chǎn)量為8.8×106個·g-1，活力88%。

2 當前存在的問題

目前已有不少木本植物建立了比較完善的原生質(zhì)體制備體系，而茶樹原生質(zhì)體分離的報道較少，仍處在不斷探索的階段。

從分離材料來看，在現(xiàn)有研究中，分離材料相對單一，而且每項研究中往往只選擇一個品種進行原生質(zhì)體分離條件的探究，具有一定的局限性。在兩份專利申請中，選定茶樹花瓣為分離材料[29-30]，但一方面花瓣獲得具有季節(jié)性，另一方面在生產(chǎn)茶園中茶樹花量較少，材料來源受限。其他報道選擇的分離材料以實生苗葉片為主，在室內(nèi)培養(yǎng)，嫩度較高，原生質(zhì)體分離難度相對小，但是獲取材料要求的時間長，首先需要獲得健康有活力的茶樹種子，經(jīng)過栽培，茶籽萌發(fā)，長出4、5片真葉才能取材實驗，而茶樹種子一年中只有10～11月份才有收獲[43]，所以取材仍然存在限制。而栽培型茶樹的葉片在結(jié)構(gòu)上更為復(fù)雜，角質(zhì)層和蠟質(zhì)層相對較厚，而且柵欄組織層次多[44]，使得酶解液不容易深入葉片的葉肉細胞內(nèi)部，增大了原生質(zhì)體分離的難度；由于茶樹為多年生植物，葉片成熟度較高，彭章等[32]在研究中曾以茶園生長的茶樹的一芽三葉為材料進行原生質(zhì)體分離，但是在其處理條件下并未獲得完整的原生質(zhì)體，而且產(chǎn)生了大量的碎片，說明葉片成熟度對分離效率存在一定影響；此外，茶葉中的多酚類物質(zhì)在細胞被酶解時易被氧化而使所得的原生質(zhì)體活力下降[31-32]。胚性懸浮細胞或愈傷組織等更能忍受酶對細胞膜的傷害，且易培養(yǎng)、易分化等，是其它木本植物獲得原生質(zhì)體的常用制備材料[45]，但建立穩(wěn)定可靠的懸浮培養(yǎng)體系需要多次繼代，而且由胚性愈傷到胚性懸浮細胞需要3個月[46]，周期較長。中村順行[27]曾以愈傷組織為材料進行原生質(zhì)體分離，但效果不佳，僅分離出少量細胞。

從酶解條件來看，不同文獻中酶解液的組分及比例有一定的差異，無法直接比較分離效果，已有的文獻中主要使用纖維素酶、果膠酶和離析酶對原生質(zhì)體進行分離，由于材料的差異性，存在多種不同的最適組合，需要綜合考慮酶解時間、產(chǎn)量和活力等多個因素，因此尚未有可參考的標準。在滲透壓的選擇上，劉艷麗等[31]認為0.5M甘露醇濃度較適宜，而彭章等[32]則發(fā)現(xiàn)在0.4M甘露醇濃度的環(huán)境下原生質(zhì)體的狀態(tài)最好，說明在不同的實驗條件下，處理條件的優(yōu)化具有一定的針對性。在酶解效果的鑒定上，中村順行[27]和劉艷麗等[31]在研究中重點關(guān)注原生質(zhì)體的形態(tài)完整性，只是定性描述了外形和數(shù)量差異，缺乏活力鑒定。可見在原生質(zhì)體制備過程中，由于變量過多，實驗的重復(fù)性較差，因此在研究過程中需要建立新的研究體系，以期最大限度擴大制備材料獲取來源和提高原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力。

從原生質(zhì)體應(yīng)用來看，雖然目前已經(jīng)有報道證明了茶樹原生質(zhì)體分離的可行性，但目前的實驗基本上大都處在原生質(zhì)體制備階段，楊子銀等[29]在2016年申請的專利中將外源基因轉(zhuǎn)化入茶樹花原生質(zhì)體，表達率可達30%以上，證明原生質(zhì)體可用于基因功能驗證和亞細胞定位等方面；彭章等[32]進行了原生質(zhì)體應(yīng)用的初步探索，利用PEG法嘗試把分離到的原生質(zhì)體融合，獲得10%的融合率，但后續(xù)并未有詳見報道。在現(xiàn)有的茶樹原生質(zhì)體制備體系中，分離材料需要經(jīng)過一系列繁瑣的步驟才能最終得到原生質(zhì)體，在此過程中容易受到機械損傷和化學(xué)損傷，原生質(zhì)體的活力大大降低，原生質(zhì)體培養(yǎng)的難度加大，而且成活率不高，進一步阻礙了原生質(zhì)體的應(yīng)用。因此，建立一種簡便高效且獲取原料易得的茶樹原生質(zhì)體制備體系，對于茶樹新品種創(chuàng)制、特異性代謝產(chǎn)物生物合成的瞬時表達、基因功能驗證等研究是很有必要的。

3 研究展望

綜合考慮實驗材料的特性，筆者認為未來以葉片為主要材料進行原生質(zhì)體制備將有更多的可能性。首先，在一定程度上可以解決一些材料的季節(jié)性限制，而且取材更方便、材料更豐富。針對茶樹葉片的結(jié)構(gòu)特點，目前已經(jīng)有直接去除葉片表面蠟質(zhì)的方法[47]，或可借鑒。雖然茶樹葉片中存在大量的多酚類化合物，但抗壞血酸和PVPP已被證明能有效減輕原生質(zhì)體的褐化，提高活力。組培苗和實生苗的生長不受環(huán)境氣候影響，可以保證葉片嫩度；而栽培型茶樹的嫩葉生長的時間跨度長，生長輪次多，可以較長時間供應(yīng)材料。由于愈傷組織和胚性懸浮細胞的細胞壁較薄，沒有角質(zhì)和蠟質(zhì)的阻礙，作為實驗材料理論上可以有效降低分離難度。

影響原生質(zhì)體分離效率的因素較多，而通過正交實驗對不同品種不同類型的材料進行處理，可以明確單個因素對于結(jié)果的影響水平，從而優(yōu)化實驗參數(shù)，確定不同材料原生質(zhì)體制備所需要的最佳條件范圍，構(gòu)建出適用于大多數(shù)茶樹品種的原生質(zhì)體分離體系。谷戰(zhàn)英等[23]通過正交試驗研究發(fā)現(xiàn)在四個因素中(纖維素酶、離析酶、酶解時間及甘露醇濃度)，酶解時間是影響油桐原生質(zhì)體產(chǎn)量獲得和活力大小的最大因素，進而建立了油桐葉肉細胞原生質(zhì)體分離體系；王歡等[48]以刺槐愈傷組織為材料進行5因素4水平的正交試驗，認為酶液質(zhì)量分數(shù)和果膠酶對結(jié)果的影響最為顯著。此外還可以通過切片觀察葉片柵欄組織和海綿組織的厚度以及角質(zhì)層、蠟質(zhì)層的分布，可以探究葉片嫩度與最適處理條件之間的關(guān)系[49-50]，發(fā)現(xiàn)葉片結(jié)構(gòu)與最適酶濃度之間的潛在規(guī)律。