胰腺癌循環腫瘤細胞檢測技術及臨床應用前景

楊笑盈，秦 騁，趙邦博，李天浩，曹洪滔，王維斌

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院基本外科，北京 100730

手術切除可能是目前治愈胰腺癌的唯一方式，但由于其起病隱匿、早期癥狀不典型，且缺乏早期診斷的生物學標志物，多數患者就診時腫瘤已發生局部侵襲或遠處轉移而失去最佳手術治療時機，患者預后較差，5年生存率不足9%[1- 3]。此外，胰腺癌術后復發和轉移未能早期發現，亦是導致患者預后不良的主要原因。因此，早期診斷并及時發現轉移灶對指導胰腺癌臨床治療及改善患者預后至關重要。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是一類通過循環系統從局部腫瘤擴散至遠處部位的腫瘤細胞，其保留了原發腫瘤的基本特征。目前認為，胰腺癌復發和轉移的關鍵在于CTCs發生早期微轉移，因此早期對血液中的CTCs進行檢測有助于早期發現腫瘤遠處轉移。本文對目前胰腺癌診斷方法的應用現狀、CTCs富集方法及CTCs檢測在胰腺癌早期篩查、遠處轉移與預后評估中的應用前景進行梳理和總結。

1 常規胰腺癌評估方法

目前，影像學、糖鏈抗原19- 9(carbohydrate antigen19- 9，CA19- 9)以及組織病理學仍是胰腺癌篩查、臨床分期、預后等的常規評估方法。

1.1 影像學

影像學檢查主要包括CT、MRI或PET/CT，其對體積較大病灶的檢出率較高，對于一些微轉移灶如粟粒樣微小轉移灶，術前增強CT甚至PET/CT均無法發現，部分患者由于在術中才發現微轉移灶而被迫中止手術。研究顯示，對于微小肝轉移灶，CT和MRI檢查的靈敏度分別為69%和85%，約20%的患者通過影像學評估導致腫瘤分期被低估，影響治療方案的選擇[4- 5]。因此，僅通過影像學檢查對胰腺癌早期診斷及病情評估具有局限性。

1.2 CA19- 9

CA19- 9是目前胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)診斷的首選腫瘤標志物，其血清水平與腫瘤分期相關，較高水平的CA19- 9常提示腫瘤處于中晚期。但CA19- 9表達受多種因素的影響，特異性較差，其在多種良性病變(如胰腺炎、急性膽管炎、肝硬化)和惡性腫瘤(如大腸癌、胃癌、膀胱癌、子宮鱗狀細胞癌)中亦可異常升高[6]。此外，Lewis抗原(巖藻糖基轉移酶)是CA19- 9的關鍵合成酶，約15%的人群該基因型表達異常，無法正常分泌CA19- 9，因此血清CA19- 9水平極低，導致臨床假陰性[7]。最近有研究認為，CA19- 9與其他多種血清標志物(如蛋白質代謝物)聯合檢測可能有助于PDAC的早期診斷與疾病分期[8]。Bernard等[9]研究表明，CA19- 9結合循環腫瘤DNA以及患者性別、腫瘤轉移部位等進行多因素分析可預測胰腺癌患者的總生存期(overall survival，OS)。但由于相關研究較少，確切研究結果尚需進一步驗證。

1.3 組織病理

內鏡超聲引導下細針穿刺術(endoscopic ultrasonography guided fine-needle aspiration，EUS-FNA)是獲取活檢標本的首選檢查，其陽性率約為80%～95%。內鏡超聲可發現毫米級微小病變，當影像學難以區分胰腺腫塊性質時，EUS-FNA有助于胰腺占位病變的良惡性鑒別。但臨床操作過程中，存在穿刺吸取標本量過少、涂片質量差等現象，導致假陰性結果。有研究認為對EUS-FNA獲取的胰腺病理樣本進行原癌基因(如K-ras)突變檢測和抑癌基因(如p16、DPC4)缺失檢測可提高其診斷的準確性。但EUS-FNA活體組織檢查為有創檢查，難以作為早期篩查的手段。因此，探究新的胰腺癌評估方法具有重要臨床意義。

2 CTCs檢測技術

目前研究認為CTCs是介導腫瘤轉移的重要因素[10- 12]，檢測血液中CTCs含量可能對胰腺癌的臨床分期、療效監測及預后評估均有幫助。目前CTCs的檢測主要包括富集、分離、計數等步驟，而外周血中CTCs相較于血細胞含量極少，約為1/109～1/106，因此富集外周血中的CTCs是檢測的重要環節[13]。近年來液體活檢技術逐漸引起臨床關注，外周血中CTCs的分離、富集技術亦得以快速發展。目前CTCs檢測技術可通過CTCs的物理特性或生物學特性與血液中其他細胞進行區分，并將其富集、分離，但尚不能確定CTCs的最優檢測方法。

2.1 基于物理特性

CTCs的物理性質主要包括其大小、可變形性、密度和電荷。研究表明，CTCs通常比其他血細胞體積更大且密度更低[14]。因此，可基于此將血液樣本稀釋并鋪在培養基上，經離心、密度梯度法分離CTCs或利用CTCs體積較大的特性將其從血液中過濾出來。如ISET系統(Rarecells，Paris，France)使用具有8 mm圓柱形孔的聚碳酸酯膜過濾器從血液樣本中富集CTCs[15]。

2.2 基于生物學特性

CTCs的生物學特性主要包括表面標志物及免疫親和力，可利用不同抗體對血液中細胞表面抗原的吸附作用不同進行篩選，即使用與CTCs細胞膜表面特定抗原結合的抗體標記、包被磁性微珠，并施加磁場以將被標記的CTCs吸附至微珠上，以達到分離、富集CTCs的目的。此種基于表面抗原的富集方法分為“正選擇”和“負選擇”。正選擇直接通過CTCs的表面標志物，如上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)陽性選擇相應的抗體從而將其富集，負選擇則通過相應的抗體標志物(主要為CD45)并耗盡血液中其他細胞(主要為白細胞)，從而篩選出CTCs[16]。目前使用較廣泛的選擇系統是CellSearch系統(Janssen Diagnostics Raritan，NJ)，該系統亦是目前美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準的唯一可用于檢測分離CTCs的平臺。CellSearch系統基于EpCAM抗體免疫磁性微珠捕獲CTCs，并通過細胞角蛋白(cytokeratin，CK)8、18和19陽性，及血液特異性細胞表面標記CD45陰性，含有核成分DAPI陽性富集并鑒定分離CTCs[17]。

此方法存在一定的局限性，因不同患者之間CTCs表面蛋白差異性較大，即使同一患者的不同樣本，EpCAM或CTCs上其他表面蛋白的表達仍存在異質性。Went等[18]報道，盡管78%的PDAC患者的CTCs表面蛋白上EpCAM為陽性，但CTCs可通過上皮間質轉化降低其EpCAM的表達水平。

Khoja等[19]入選54例胰腺癌患者比較了CellSearch系統與ISET系統對CTCs富集、檢測效率，結果顯示ISET系統檢出CTCs的患者數比CellSearch系統多，且對分離出的CTCs進行細胞計數發現，同樣血液量中，ISET系統檢出的CTCs數量明顯更多。CTCs表面標志蛋白存在異質性可能是導致CellSearch系統檢出率低的原因之一。ISET系統能檢測出聚集成團的CTCs，但對于體積較小的CTCs(如小神經內分泌腫瘤細胞)則存在漏檢的可能[20]。因此，目前尚無檢測CTCs的標準方法，由于不同參考文獻中的標準不同，難以比較不同系統的優劣。

3 CTCs在胰腺癌評估中的應用

2007年，Nagrath等[21]使用CellSearch系統富集、檢測15例PDAC患者的CTCs，結果顯示所有患者均可檢測到CTCs(跨度范圍9～831 CTCs/mL，中位數120 CTCs/mL)。Iwanicki-Caron等[22]對疑診為PDAC的患者采用ScreenCell系統檢測CTCs，并通過EUS-FNA收集可疑胰腺腫瘤細胞，結果發現85%的患者經EUS-FNA確診為PDAC，其中70%可檢測出CTCs，認為可考慮通過檢測CTCs來診斷PDAC。Zhang等[23]使用hTERT啟動子調節的溶瘤性單純皰疹病毒- 1靶向端粒酶逆轉錄酶陽性的腫瘤細胞，檢測不同臨床階段的胰腺癌患者CTCs表達情況，結果顯示88.2%(15/17)的患者檢出CTCs。Chang等[24]開發了一種平行微流控芯片，該芯片與免疫磁性吸附和基于物理特性過濾等不同策略相結合對胰腺癌患者的CTCs分離效果良好，胰腺癌患者的CTCs檢出率為91.7%(11/12)，非小細胞肺癌患者的CTCs檢出率為100%(38/38)。

上述研究表明，基于目前的檢測技術對PDAC患者進行CTCs定性檢測或定量分析具有可行性，但不同檢測技術的結果仍存在較大差異。

3.1 篩查

Rhim等[25]采用黃色熒光蛋白譜系標記物標記了KPC小鼠的所有胰腺細胞，檢測了胰腺上皮內瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)階段小鼠血液中循環胰腺細胞(circulating pancreatic cells，CPCs)，發現CPCs表達的胰腺癌干細胞標志物CD44和CD24水平升高。此外，該研究發現CPCs可滲入骨髓、腎臟等組織，并表達Fsp1和Zeb1等間充質表面標志物，可作為胰腺癌患者死亡的獨立預測因子。提示處于癌前病變時，胰腺腫瘤細胞即可離開原器官發生早期轉移，CPCs可能是早期胰腺癌的標志物。在隨后的研究中，Rhim等[26]在3個不同的受試者組(所有階段的PDAC患者、腫瘤前囊性病變以及無癌對照人群)中捕獲CTCs，結果顯示PDAC患者和對照人群的CTCs檢出率分別為73%(8/11)和0(0/19)，且40%(8/21)的腫瘤前囊性病變患者血液中可檢測到CTCs，提示CTCs可用于胰腺癌的篩查。但Cauley等[27]通過ScreenCell系統對188例受試者進行CTCs檢測，結果發現健康受試者未檢出CTCs，胰腺癌、癌前病變及胰腺良性病變中，均有一定比例的患者可檢出CTCs，且3組間CTCs檢出率無顯著性差異。因此，CTCs在胰腺癌早期診斷與篩查中的確切作用需進一步研究證實。

3.2 分期

CTCs水平對胰腺癌早期出現的遠處轉移具有重要提示意義。Kamande等[28]研究發現，轉移性PDAC患者的CTCs水平顯著高于局部可切除PDAC患者，但該研究納入的受試者僅12例(包括7例轉移性PDAC患者及5例局部可切除PDAC患者)。Court等[29]對126例胰腺癌患者術前進行CTCs檢測，得到了相似結果，即合并隱匿轉移性胰腺癌的患者與局灶性胰腺癌患者相比可檢出更多的CTCs，差異具有統計學意義。但亦有少數研究結果顯示CTCs水平與胰腺癌淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期無關[30]。

胰腺癌患者預后較差主要歸因于腫瘤較早出現遠處轉移，但尚無在無癥狀人群中甄別出早期胰腺癌的有效方法[31]。目前研究認為在胰腺癌發生轉移的早期，即可在血液中檢出CTCs，為胰腺癌早期診斷及轉移篩查提供了可能性。但相關研究較少，且部分假陰性及假陽性結果的原因尚不清楚，確切結論及其應用價值需深入研究。

3.3 預后

通過不同平臺檢測CTCs的研究均表明，CTCs可能是PDAC患者預后的獨立影響因素。Soeth等[32]通過巢式CK20實時PCR在52例PDAC患者(52/154，33.8%)中分離出了CTCs，并發現這些患者的OS比未分離出CTCs的患者顯著縮短。Kurihara等[33]使用CellSearch系統對26例胰腺癌患者進行CTCs檢測，結果顯示11例檢出CTCs，且此類患者的OS顯著縮短。de Albuquerque等[34]在34例患者的研究中亦得到了一致的結果。Bidard等[35]進行了一項多中心隨機對照臨床試驗，該研究納入79例局部晚期非轉移性PDAC患者，分別接受吉西他濱單藥治療或吉西他濱+厄洛替尼治療，通過CellSearch系統在2個不同的時間點(基線和治療2個月時)進行CTCs檢測。結果表明，CTCs的總體陽性率為11%；多因素分析顯示任意時間點CTCs陽性是局部晚期胰腺腺癌OS縮短的危險因素，但其對患者的無進展生存期(progression-free-survival，PFS)無顯著影響。Gao等[36]通過非EpCAM依賴性方法富集、檢測胰腺癌患者CTCs，發現CTCs數目升高(≥3 CTCs/7.5 mL)患者的OS較CTCs數目較低患者(<3 CTCs/7.5 mL)明顯縮短(10.2個月 比 15.2個月)，且多因素分析顯示CTCs數目升高是胰腺癌患者OS較短的危險因素(HR=4.547，P=0.016)。Poruk等[37]基于物理特性富集并分離出CTCs后，對panCK和波形蛋白分別進行免疫熒光染色，比較了上皮型CTCs(CK陽性)和間質型CTCs(波形蛋白陽性)患者的預后情況，發現上皮型CTCs與較短的OS密切相關(P<0.01)，但間質型CTCs與OS無相關性(P=0.39)。大量研究證實，CTCs陽性不僅提示胰腺癌患者OS縮短，且是PFS縮短的危險因素[38- 40]。

有部分研究認為，從門靜脈分離出的CTCs與全身循環系統分離出的CTCs可能存在潛在差異。Catenacci等[41]在18例胰腺癌或膽管癌患者中均可檢出門靜脈CTCs，而其中僅有22%的患者外周血可檢出CTCs。Bissolati等[42]在對20例胰腺癌患者的研究中，9例(45%)患者可檢出CTCs，其中5例僅在門靜脈中檢出CTCs、3例同時在門靜脈和外周血中檢出，1例僅在外周血中檢出；隨訪3年可知，相比門靜脈CTCs陰性的患者，CTCs陽性者具有更高的肝轉移率。Tien等[43]收集了41例PDAC患者術中門靜脈和外周血樣本，僅發現門靜脈CTCs數量升高是PDAC患者術后6個月肝轉移的重要預測指標(P=0.002)。上述結果表明，門靜脈血液中的CTCs比外周血中的CTCs更易被檢出，且與PDAC潛在轉移的關系更密切。但上述研究樣本量較小，且檢測方法不完全一致，從門靜脈分離出的CTCs是否更有助于臨床對胰腺癌患者進行預后判斷仍需進一步研究。

4 小結

胰腺癌作為一種惡性程度高、預后差的腫瘤，在過去數十年的探索中患者預后并未獲得明顯的改善。由于存在特殊的解剖學位置及腫瘤細胞成分相對較低等特點，胰腺癌組織活檢較為困難，而CA19- 9等分子生物學標志物及MRI、CT、PET/CT等影像學技術在胰腺癌的早期診斷和轉移篩查中均存在一定局限性。CTCs作為保留原發腫瘤特性的一類腫瘤細胞，其在胰腺癌早期即可在血液中檢測到，且獲取方便、可多次收集，為胰腺癌的早期診斷、遠處轉移篩查提供了新思路，且在實時監測腫瘤進展、對治療的反應以及預后評估中具有較好的應用前景[44]。但目前尚缺乏CTCs富集、分離的標準平臺和方法，且其在胰腺癌患者中的應用多為小樣本量研究，需進行更多、更大規模的前瞻性臨床試驗進一步驗證，以發掘其潛在價值。

作者貢獻：楊笑盈、秦騁撰寫論文初稿；王維斌負責論文設計；趙邦博負責論文修改；李天浩、曹洪滔負責文獻查閱工作；所有作者均參與本文修訂。

利益沖突：無