軟骨組織工程的研究現狀及間充質干細胞的修復策略▲

陸定貴

(右江民族醫學院附屬醫院骨外科，廣西百色市 533000)

軟骨組織由軟骨細胞和基質構成，缺乏神經、血管，損傷后自愈能力差，易發生創傷性關節炎，嚴重者可導致肢體殘疾[1]。目前臨床上治療軟骨損傷常用的方法有自體或異體軟骨移植、人工關節置換等[2]。自體軟骨可移植的數量有限，無法滿足大面積缺損患者，而同種異體移植常常有較強的排斥反應，療效欠佳。人工關節雖然在力學上已接近正常關節，但存在假體松動、使用壽命短等缺陷。組織工程學是一門與細胞生物學、材料科學緊密相關的學科，通過組織工程技術將細胞與材料有機結合，構建出有生命力的活體組織來修復病損，以達到與正常組織生物特性最大化的相似[3]。組織工程的研究內容主要包括種子細胞、細胞因子、支架材料。組織工程的概念興起以來，有關學者一直在嘗試運用組織工程技術來修復軟骨缺損。軟骨組織工程的目的是模擬軟骨修復的自然過程，通過對種子細胞、支架、細胞生物活性物質等的調控，促進軟骨組織愈合[4]。現對軟骨組織工程的相關研究作一綜述，并探討間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)修復軟骨缺損的臨床應用策略。

1 種子細胞的研究現狀

細胞是組織工程中最重要的組成部分，軟骨組織工程中常用的細胞有軟骨細胞、間充質干細胞、多能干細胞。

1.1 軟骨細胞 軟骨細胞是軟骨內唯一的細胞，具有直接分泌外基質能力，同時來源充足、體外擴增能力強、植入后細胞成活率高，是軟骨組織工程修復中理想的種子細胞[5]。軟骨細胞來源于自體正常軟骨，其制作方法為，將獲得的軟骨組織切成小塊，并在37 ℃的Ⅱ型膠原酶中消化過夜。消化后，收集釋放的細胞并在生長培養基中傳代培養，以獲取足夠的細胞用于組織工程。軟骨細胞的主要缺陷在于取材時可能會導致新的傷害。同時，獲取的軟骨細胞在擴增傳代過程中去分化明顯，逐漸失去其特征并顯示出成纖維細胞樣特征。但是，已有研究表明，水凝膠3D培養系統可以實現去分化軟骨細胞的再分化[6]。

1.2 間充質干細胞 MSCs來源于中胚層，存在于骨髓和脂肪中，具有多向分化潛能和自我更新能力，是細胞治療的重要工具。MSCs在軟骨組織工程中具有多種優勢[7]。首先，與軟骨細胞不同，MSCs可以快速生長并在較長時間內保持其特性。其次，MSCs能通過損傷部位釋放的信號因子來定位損傷部位，隨后趨化、遷移至損傷區域，并分化為多種相關的譜系，通過旁分泌活性調節炎癥和血管生成，直接分化為軟骨細胞修復病損軟骨。此外，MSCs產生多種對軟骨功能至關重要的基質分子，包括膠原蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖以及各種細胞因子。

1.3 多能干細胞 最近關于胚胎干細胞軟骨分化的研究報道吸引了研究者的注意[8]。胚胎干細胞具有無限的自我更新功能和分化成幾乎所有細胞類型的能力，可為組織工程修復提供充足的種子細胞，但胚胎干細胞的軟骨分化需要復雜的程序，同時存在倫理道德問題[9]。為了避免胚胎干細胞的倫理問題，可以通過重編程體細胞，將其誘導為多能干細胞[10]。誘導多能干細胞已經在動物模型上被證明具有成軟骨能力，但是在誘導多能干細胞的生物安全性方面仍有待研究。

2 支架材料

支架在軟骨組織工程中的作用包括提供結構支持、增強軟骨形成和指導軟骨再生。支架可分為天然支架和合成聚合物支架。理想的支架材料應滿足以下條件：(1)良好的生物相容性，對宿主無毒，無免疫排斥反應；(2)支架可降解性及其降解速率可控性，降解的產物相對無毒性；(3)支架自身有利于細胞的黏附、增殖及細胞外基質的分泌；(4)良好的可塑性及一定的機械強度[11]。聚羥基乙酸、MSCs及軟骨衍生的細胞外基質、水凝膠、羥基磷灰石、聚羥基烷酸酯是組織工程常常應用的人工可降解支架材料[12]。

目前，已有許多天然和合成聚合物被用在軟骨組織工程支架研發中。天然聚合物(如膠原蛋白、殼聚糖、絲素蛋白、藻酸鹽、透明質酸和硫酸軟骨素)具有出色的生物相容性和生物降解性，適合啟動快速再生過程[13]。但是，天然聚合物潛在的病原體傳播、免疫原性和機械性能較差限制了其臨床應用。而合成的聚合物可以人為地調節聚合度，從而控制其機械性能、內部結構和降解，可以有效地促進再生過程[14]。聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙交酯-乙醇酸和聚己內酯是三維支架用于軟骨組織工程中最常用的聚合物[15]。

組織工程支架的適用性由許多相關因素決定。生物材料應具有生物相容性和細胞啟發性，具有多孔性和孔隙連通性，有利于細胞遷移和營養物質及組織廢物的運輸。對于承重組織的工程，支架需要具有特定的機械性能和確保機械刺激轉移到細胞以指導其分化。實現這些設計目標是具有挑戰性的，但或許可以通過集成計算工具如有限元建模與三維打印技術來實現，以評估支架結構和材料特性如何影響植入物的性能。但這需要探索不同纖維直徑、間距和放置方式對生物支架的結構和力學性能的影響[16]。

3 細胞因子

細胞因子是軟骨組織工程的三要素之一，良好的細胞因子對干細胞或軟骨細胞具有極佳的生物相容性，可促進干細胞趨化、黏附、定植、增殖、分化為軟骨細胞并分泌軟骨基質。軟骨組織工程修復過程是由多種細胞因子之間共同作用的結果，目前研究較為深入的細胞因子主要有轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)家族和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、骨形態發生蛋白質(bone morphogenetic protein，BMP)[17]。

TGF-β由兩條相同或相似的肽鏈組成，分子量為25 kDa。TGF-β是間充質前體細胞軟骨形成的主要引發劑之一，并且MSCs向軟骨細胞的分化也需要其刺激。同時，TGF-β具有誘導軟骨細胞合成蛋白聚糖和合成Ⅱ型膠原蛋白的功能[18]。TGF-β有三種同工型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，其促進軟骨分化的能力沒有顯著差異，并且TGF-β促進軟骨形成分化主要取決于第一周的刺激程度[19]。

IGF有IGF-1和IGF-2兩個亞型。研究證明IGF的兩個亞型均能促進軟骨細胞增殖，刺激軟骨細胞外基質，對軟骨修復有益[20]。特別重要的是，IGF-1能夠獨立地誘導MSCs向軟骨細胞分化。與單獨使用IGF-1相比，將IGF-1和TGF-β1協同使用對透明質軟骨的形成具有更好的作用，并出現改善的細胞排列[21]。此外，IGF-1和BMP-2協同使用時可促使分化后的細胞高表達Ⅱ型膠原蛋白、降低基質金屬蛋白酶表達[22]。而IGF-1與其他生長因子聯合用于體內軟骨修復和最佳遞送策略仍有待充分闡明。

FGF與軟骨細胞增殖、基質合成、細胞穩態密切相關。FGF-2是FGF家族最受關注的代表性成員。在體外環境中，FGF-2上調MSCs的SOX9基因表達水平，從而通過啟動軟骨分化機制加速細胞分化[23]。有研究將FGF-2摻入纖維蛋白凝塊并植入軟骨損傷處，證明了其可促進關節軟骨的再生修復。但是，FGF-2與BMP-6或TGF-β組合時會抑制后者誘導軟骨分化的能力[24]。因此，FGF與其他生長因子在軟骨形成分化過程中的相互作用尚待進一步研究。

PDGF對間充質來源的細胞具有有效的促有絲分裂和趨化作用。PDGF-BB干預的軟骨細胞以劑量依賴性方式顯著增加，并且增強了軟骨基質的產生。在動物實驗中[25]，PDGF可顯著增強兔子模型中軟骨缺損部位的透明軟骨再生。機制可能是PDGF上調了一種與細胞生長和遷移有關的蛋白(G蛋白偶聯受體激酶互作蛋白1)，隨后促進了軟骨細胞的增殖和遷移。然而，在人軟骨細胞中加入PDGF會刺激去分化相關基因的表達，因此，需要進一步評估PDGF在軟骨組織工程學中的益處。

BMP是TGF-β超家族的成員，因此也可以通過TGF-β經典的Smad和非Smad途徑誘導干細胞分化，形成軟骨并促進軟骨基質的合成[26]。目前已有許多BMP的亞型被發現，其中BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7在軟骨組織工程領域的研究最廣泛。BMP-2在整個軟骨形成過程中都高度表達。因此，其已普遍用于改善體外和體內軟骨的再生。但BMP不同亞型誘導軟骨再生的能力仍然存在爭議，大多數BMP還可誘導成骨，由此引起的異位骨化是一個重要的問題，需要進一步研究并加以克服。

4 間充質干細胞的修復策略

軟骨組織工程常用的種子細胞是MSCs和自體軟骨細胞。MSCs易于從組織中分離，體外擴增能力強，且具有很強的成軟骨潛能，成為軟骨組織工程中最具修復能力的種子細胞[27]。廣泛的臨床前試驗已經證實，MSCs在軟骨分化因子的作用下可以分化為軟骨組織，可修復受損的軟骨。

用于軟骨修復的MSCs可以從外源性獲取或內源性獲取。內源性獲取MSCs主要是通過微骨折手術，采用克氏針在軟骨下骨板上鉆孔，以打通軟骨下骨髓腔，通過炎癥作用，刺激骨髓腔里的MSCs趨化、定植于損傷區[28]。外源性獲取MSCs是通過宿主的其他組織獲得MSCs，然后通過手術切口或關節內注射植入關節中，以進行小規模的軟骨修復。不論MSCs是外源性或內源性來源，都需要趨化、遷移、定植于損傷區，才能發揮細胞代謝功能、修復作用，這一過程稱為“歸巢”。

組織修復過程需要有足夠數量的細胞歸巢到靶組織。然而，不論是外源還是骨髓遷移途徑，僅有小部分移植細胞能到達靶組織，且移植細胞存活率極低[29]。歸巢包括非系統歸巢和系統歸巢。非系統歸巢是指細胞在靶組織內移植，然后通過趨化因子濃度梯度引導到靶組織；系統歸巢是移植細胞被管理或內源性招募到血液中，經過多步驟的過程，以退出循環和遷移到損傷部位。研究表明[30]，經外周靜脈移植的干細胞在移植15 min后有80%存在于肺組織。4 d后，移植細胞呈指數下降至0.01%。另外，介于損傷區域自由基產生、免疫炎性反應等，趨化遷移來的移植干細胞約7 d內凋亡[31]。MSCs雖然具有修復受損組織、儲存生長因子和再生分子的能力，然而MSCs歸巢效率低下，歸巢消耗是實現MSCs完全治療潛力的主要瓶頸[32]。

MSCs治療所面臨的最大挑戰之一是提高其歸巢效率。MSCs的歸巢機制目前已知其涉及滾動、激活、俘獲、穿越、遷移等步驟[33]，但尚不清楚哪些步驟是MSCs消減的主要瓶頸。目前已采取多種方法來改進MSCs歸巢。這些策略可大致分為七種：(1)靶向給藥；(2)磁引導；(3)基因修飾；(4)細胞表面工程；(5)體外啟動；(6)靶組織的修飾；(7)放射治療技術[34]。這些策略中有一些側重于非系統性歸巢，如靶向給藥和磁引導。每種方法都有自己的缺點，而且因靶組織的不同，靶向給藥的作用有限。對MSCs的修飾也并不能完全阻止其分布到非靶器官。另一方面，通過化學或基因手段改變靶組織會引起安全問題。目前也有觀點認為利用超聲增強MSCs歸巢是一個有效途徑，可以很容易地進入靶向深部和淺部器官，但這一觀點仍需更多的研究支撐。

雖然歸巢可能是實現MSCs療法的主要障礙，但其他障礙也同樣存在。在臨床設置中使用的MSCs來源于健康的供體，盡管這些細胞在定義表面標記的表達中可能是均質的，但它們的功能并不一定是均質的。此外，MSCs的大規模體外擴增會導致衰老，削弱其治療效果[35]。臨床試驗幾乎普遍使用剛解凍的MSCs。冷凍保存易損害MSCs的免疫抑制特性，并縮短它們在體內的維持時間[36]。

5 結 語

軟骨組織工程學的出現，拓展了軟骨缺損治療的方式方法，有望克服目前軟骨損傷臨床治療的缺點。目前軟骨組織工程的支架材料和細胞因子研究已經取得很大進步，且成功開發出各種基于聚合物支架的控釋系統，并用于控制生長因子的遞送，以促進軟骨再生。而基于MSCs作為種子細胞的軟骨組織工程細胞來源得到了充分保障，同時具有出色的軟骨分化能力，規避了當前臨床治療的局限性。但是仍需注意還有諸多難點有待解決，例如如何促進細胞歸巢、如何提高移植細胞的存活率及其活性等。雖然仍有許多工作要做，但這些研究將繼續推動細胞治療領域的發展。