環狀RNA對胃癌診斷及預后的影響

李勇瑜，宋 健

（海南醫學院：1臨床醫學專業；2附屬腫瘤醫院消化內科，海南海口 570312）

胃癌是消化道惡性腫瘤的常見病，具有早期易漏診，中、晚期預后不良的特點。盡管目前內鏡下活檢仍是胃癌確診的主要手段，但是其價格貴、耐受性差，患者普遍接受度不高，且癌胚抗原（CEA）、糖抗原199（CA19-9）等特異性、敏感度低的非特異性腫瘤相關抗原對胃癌更不具有針對性提示意義。近年隨著RNA 測序技術的不斷進步，越來越多的cir?cRNA在胃癌患者中被檢測出來，其在胃癌組織及其癌旁組織與血漿中的表達差異性與胃癌的發生發展、診斷及其預后關系不斷被深入發掘，使circRNA成為胃癌診斷及其預后的新型生物標志物奠定了一定的基礎。

1 circRNA的概述

1.1 circRNA的特征

circRNA首次被發現存在于RNA植物病毒中[1]。隨后發現少部分的真核生物中也存在相關的cir?cRNA，但相關文獻報道較少，學術界普遍認為其是DNA 轉錄過程中錯誤剪接的產物[2]。隨著RNA 測序技術的深入研究，circRNA 被發現廣泛存在于人體組織細胞、血液中[3-4]。與線性RNA（linearRNA）相比，circRNA 具有以下特征[3-6]：①穩定性：由于circRNA反向首尾連接形成封閉環狀結構，無游離5′帽和3′尾，有抗RNase 及RNA 外切酶的特性，使其具有高度保守性、穩定性以及長半衰期（＞48 h）。②分布特異性：通過異常剪接外顯子或內含子序列來源的前體mRNA 可產生不同的circRNA，前者主要定位于細胞質，后者則定位于細胞核。③表達差異性：在人體不同組織或體液中差異表達，對腫瘤、疾病的發生發展具有重要意義。④數量多：多種蛋白基因編碼可共同轉錄產生數量豐富的circRNA。

1.2 circRNA的類型和產生機制

產生circRNA 的供體種類繁多，但形成的cir?cRNA 主要分成四類[3-6]：純外顯子的circRNA（ecir?cRNA）、純內含子的circRNA（ciRNA）、外顯子-內含子的circRNA（eiciRNA）以及前體tRNA 形成的cir?cRNA（tricRNA）。另有研究表明染色體易位畸形[7]和環形DNA病毒[8]也可形成circRNA。不同于線性RNA傳統的剪切方式，circRNA的產生機制可能包括：①直接反向剪接、外顯子跳躍和RBP抖動：直接反向剪接是ecircRNA 和eiciRNA 最常見的環化方式，含有ALU重復序列的特殊前體mRNA通過反向堿基互補配對后剪切形成ecircRNA[3]。外顯子跳躍是通過剪接體提供的供、受體位點連接兩端外顯子構成套索選擇性剪接產生ecircRNA[3]。RNA 結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）通過識別兩側內含子位點促進外顯子反向剪接形成ecircRNA 即RBP 抖動[9]。三種機制過程中若保留內含子則可形成eiciR?NA。②內含子套鎖驅動環化：富含GU 堿基和（或）C堿基保守序列的前體mRNA 促進內含子反向互補，剪接3′末端驅動套索環化形成ciRNA[3]。③tricRNA是前體tRNA 內含子經剪接環化形成[10]。④其他：sn?RNP（小核核糖核蛋白）結合前體mRNA可促進環化形成[11]。

1.3 circRNA的生物學功能

1.3.1 充當微小RNA（microRNA，miRNA）海綿 充當miRNA 海綿是circRNA 最突出的功能。circRNA作為miRNA的內源性抑制劑，通過競爭性抑制miR?NA結合目標mRNA基因，從而影響蛋白質翻譯和基因調控。有研究表明，源于HIPK3 基因Exon2 的circHIPK3 可結合9 種miRNA 與有18 個結合位點，競爭性結合miR-124 產生負調節作用，促進腫瘤細胞生長增殖[4]。ciRS-7是miR-7的典型海綿，含74個靶位點，高效結合miR-7并促進其靶基因表達，增加肝癌、結腸癌等腫瘤的發展風險[12]。然而，有研究證實circRNA并非有多miRNA靶點才具有調控基因的能力，如circTP63 可作為miR-873-3p 海綿，特異性結合后可正調控miR-873-3p 靶基因FOXM1 表達，促進肺鱗狀細胞癌的進展[13]。circTGFBR2 能夠與miR-107 相互作用，抑制miR-107 表達同時促進該靶點基因TGFBR2 表達上調，抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲[14]。

1.3.2 調控基因表達 不同的circRNA 有不同的調控親本基因表達的方式。已有研究表明，ciRNA 與eiciRNA主要定位于細胞核中，可通過順式調節方式參與RNA 聚合酶II 復合物促進親本基因轉錄。例如，Li 等[15]證明circEIF3J、circPAIP2 與其親本基因EIF3J和PAIP2的表達成正相關。Lai等[16]認為來源于SERPINB5 和GDA mRNA 編碼基因的hsa_circ_0047905 和hsa_circ_0138960 與對其親本基因有正調控作用。Zeng等[17]研究表明circSIRT7與PolⅡ結合作為其親本基因SIRT7 的順式因子。ecircRNA 主要定位于細胞質中，可與RBPs 結合調控mRNA 表達。另外，eiciRNA 可充當RBPs 海綿，具有類似ecir?cRNA 的作用。例如，Du 等[18]研究發現，circFoxo3 與FAK 和HIF1α蛋白相互結合，可調節衰老和應激抗性。

1.3.3 翻譯蛋白質功能 circRNA 非絕對意義上的非編碼RNA，少部分circRNA 可與核糖體結合進而參與翻譯過程。Yin等[19]在證實circFAM188B具有促進雞骨骼肌衛星細胞增殖能力的基礎上，進一步發現其具有編碼多肽circFAM188B-103aa 的潛力，且后者與其親本轉錄物circFAM188B 的作用一致。此外，在人體腦細胞中，來源于SHPRH基因和FBXW7基因的circSHPRH和circFBXW7可分別編碼多肽和蛋白質，抑制膠質瘤的發生發展[20-21]。有研究證實，circErbin 可吸附miR-125a-5p 和miR-138-5p，協同靶向真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白1（4EBP-1），從而介導cap 非依賴性HIF-1α蛋白翻譯，促進結直腸癌的生長及轉移[22]。然而，Wu等[23]卻研究發現cir?cYap有負調控作用，通過結合eIF4G和PABP阻止起始翻譯。

綜上所述，circRNA 不僅可以充當miRNA 和RBPs海綿對mRNA發揮調控作用，還可以調控蛋白質翻譯影響疾病的發生發展。此外，研究表明紅景天苷可通過上調hsa_circ_0000064 水平來減弱缺血再灌注損傷心肌細胞的自噬和凋亡，有效改善心功能，縮小心肌梗死面積[24]。然而，circRNA 的研究絕非止步于此，更多的生物學功能有待進一步發掘。

2 circRNA與胃癌的關系

胃癌是消化道惡性腫瘤中的常見病，其預后與腫瘤的侵襲、轉移有關。雖然目前胃癌的治療手段有很大的提升，但患者的預后、生存情況并未有效改善，其根本原因在于不能及時進行早期診斷。隨著研究深入，發現circRNA與胃癌的發生發展密切相關，使其作為胃癌診斷、預后評價的生物標志物存在著巨大潛力。

2.1 circRNA與胃癌發生、發展的關系

circRNA 通常在轉錄或轉錄后水平調控基因表達，其中主要以充當miRNA海綿、circRNA表達失調以及circRNA 作為上皮細胞-間質轉化（epitheli?al-mesenchymal transition，EMT）過程中重要組分參與胃癌的進展過程。Niu 等[25]首次發現hsa_circ_0001829 作為miR-155-5p 的分子海綿，調節其靶基因SMAD2表達，并通過影響細胞周期進程及凋亡率來促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。Pu等[26]研究發現cirCUL3通過激活miR-515-5p促進信號轉導和轉錄活化因子3（STAT3）的表達，從而提高己糖激酶2（HK2）的轉錄水平導致胃癌細胞的增殖和葡萄糖消耗加快。有研究表明，circMTO1 通過競爭性抑制miR-199a-3p 活性，上調miR-199a-3p 下游靶基因PAWR表達水平，可提高胃癌細胞凋亡率，減少細胞侵襲和遷移[27]。此外，Ma 等[28]研究表明，hsa_circ_0004872 能通過海綿化miR-224 促進其下游靶點p21和Smad4表達上調，并通過Smad4反向抑制RNA編輯酶ADAR1 形成負調控環來影響hsa_circ_0004872的降解，從而抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。Guo等[29]發現circREPS2充當miR-558海綿，可上調RUNX3的表達，使胃癌細胞中的β-連環蛋白信號失活發揮腫瘤抑制作用。

circRNA 表達失調也可調控胃癌的發生、發展。有部分研究發現，如hsa_circ_0001829[25]、circCUL3[26]在胃癌組織和細胞系中顯著上調，皆有促進胃癌細胞增殖的作用。circMTO1 在胃癌細胞系和組織中表達明顯下調，其低表達水平與預后不良呈正相關，上調circMTO1可抑制腫瘤生長[27]。此外，在胃癌組織中hsa_circ_0004872[28]、circREPS2[29]低表達與TNM分期與腫瘤大小有關，上調表達時顯著抑制胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲及體內腫瘤的發生。

EMT過程影響癌細胞的侵襲、轉移，主要是由于上皮細胞過渡成間充質細胞，后者具有遷移能力可侵襲機體的各個部位。有研究發現，circREPS2 表達升高可負調控EMT，抑制細胞增殖、侵襲。hsa_circ_101882通過影響E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snail的表達水平正調控EMT過程[29-30]。

2.2 circRNA對胃癌的診斷價值

circRNA 與腫瘤的關系是近年的研究熱點，其中circRNA 在胃癌組織及其癌旁組織，甚至是血漿中的表達差異更是為胃癌的診斷提供有力的依據。ROC 曲線的AUC 是描述診斷試驗真實程度的常用方法。基于qRT-PCR 擴增技術，Lu 等[31]發現在胃癌組織中hsa_circ_0067582 和hsa_circ_0005758 表達均顯著降低，其中hsa_circ_0067582 與CEA 水平和臨床分期呈正相關，而hsa_circ_0005758 與CEA 水平和神經周圍浸潤呈正相關，兩者ROC曲線下面積AUC 分別為0.671 和0.721，敏感性為55.2%和75%以及特異性為75%和67.7%，具有成為胃癌診斷的潛在標志物可能。Kong 等[32]通過采用高通量測序法在胃癌組織及癌旁組織中進行大規模基因篩選，共鑒定出25303 個circRNAs，其中2007 個circRNAs 具有差異表達，并進一步驗證hsa_circ_0001821在胃癌患者的組織及全血標本中表達降低，經AUC分析顯示全血中的hsa_circ_0001821 對胃癌患者的診斷效率不僅優于胃癌組織（0.872，95%CI:0.767～0.977 vs 0.792，95%CI:0.723～0.861），且敏感性和特異性更高于CEA、CA199、CA125 傳統的標志物（0.872，95%CI:0.767～0.977 vs 0.839，95%CI:0.740～0.937;0.771，95%CI:0.649～0.893;0.742，95%CI:0.613～0.871），更甚者兩者聯合可使AUC 高達0.933，有效提高診斷胃癌的準確度。同年，研究cir?RNA作為胃癌診斷的新型標志物的隊伍逐漸擴大。有研究顯示，hsa_circ_0006848 在早期胃癌患者的胃癌組織和血漿中均呈低表達，通過血漿樣品構建ROC 曲線的AUC 為0.733，聯合CEA、CA19-9 及CA72-4 可 使AUC 升 高 至0.825，表 明 了 血 漿hsa_circ_0006848 有望能作為一種新的無創性診斷早期胃癌的生物標志物[33]。還有一部分circRNA具有成為診斷胃癌的生物標志物潛能，如Xie 等[34]發現hsa_circ_074362 在胃癌、胃炎組織及胃癌細胞系中表達水平均顯著下調，其胃癌組織的AUC 為0.630。Tang等[35]證實了circKIAA1244在胃癌患者的病變組織及血漿樣品中的表達低于正常對照組，其血漿樣品的AUC 為0.748，且外泌體中circKIAA1244 表達與血漿水平無差異，進一步擴大了胃癌診斷載體的范圍。以上研究表明了circRNA 在診斷胃癌方面有重要意義，然而目前大多數circRNA 的檢測皆在活檢組織中進行，只有少部分circRNA可在血漿、外秘體中被發現，并且通過circRNA 檢測來早期診斷胃癌的相關報道仍較少。因此，circRNA從研究過渡到臨床應用的道路還很漫長。

2.3 circRNA對胃癌的預后價值

circRNA 與胃癌臨床病理特征的關聯性，使其具有評價胃癌預后的潛力。通常來說，circRNA在胃癌中低表達可能與患者的預后成正比，而高表達則呈反比。有研究顯示，hsa_circ_0000419 在胃癌細胞系、癌組織和胃癌患者血漿中的表達水平顯著降低，其中胃癌組織hsa_circ_0000419 水平與細胞分化、Borrmann 型、總生存率和無病生存率相關，而血漿hsa_circ_0000419水平與腫瘤分期、淋巴結轉移和遠端轉移、靜脈和神經周侵襲呈正相關，可導致患者預后不良[36]。Deng 等[37]研究發現，circRHOBTB3 在胃癌細胞系和胃癌組織中表達下調，其低表達與腫瘤分期顯著相關，而與其他臨床病理參數無顯著相關性，且對比circRHOBTB3 低表達組，circRHOBTB3 高表達組患者的整體生存期明顯延長。還有研究表明，circCUL3[26]、hsa_circ_101882[30]在胃癌組織中高表達與患者的臨床分期密切相關，一定程度上可降低患者的總生存率。在胃癌患者樣本中，hsa_circ_0004872[28]、circREPS2[29]、hsa_circ_0006848[33]低表達與腫瘤體積大小相關，hsa_circ_0004872[28]、hsa_circ_0001821[32]、hsa_circ_0074362[34]、circKIAA1244[35]低表達與淋巴結轉移相關，而circREPS2[29]、hsa_circ_0006848[33]、circKIAA1244[35]低表達與TNM 分期、病理分化程度顯著相關。以上研究表明，circRNA的表達失調對評估胃癌的預后有一定的應用價值，但目前在血漿等體液中檢測circRNA表達水平的技術仍不成熟，其與組織表達水平是否具有一致性尚未有定論，且其對胃癌評估預后的可靠性、真實性還有待研究。

3 結語

circRNA 是一類特殊的非編碼RNA，其閉合環形結構使其具有酶抗性，能穩定存在于組織細胞、血漿等中，對診斷胃癌及其預后評估有潛在意義。然而，關于circRNA 對于胃癌的應用價值方面還存在一些問題：首先，大多數研究未過渡到臨床應用。由于研究的局限性，目前尚未有明確機制解釋cir?cRNA的表達差異性，很難準確地通過血漿中的表達水平對胃癌進行早期診斷和預后評估。其次，cir?cRNA能否作為干預胃癌進程的新靶點，從而達到治療目的。此外，目前circRNA與胃癌的相關研究大多是探討胃癌的發展進程以及在活組織中驗證不同circRNA的存在。因此，未來的研究方向主要是解決circRNA如何在腫瘤中發揮具體的作用機制問題以及如何將已有基礎成果向臨床應用轉化問題。