枳實總黃酮對5-氟尿嘧啶誘導的腸黏膜炎小鼠腸道菌群失調的影響

劉丹寧，潘夢雪，楊璐嘉，黃潔瑤，任 巧，袁呂江

枳實總黃酮對5-氟尿嘧啶誘導的腸黏膜炎小鼠腸道菌群失調的影響

劉丹寧，潘夢雪，楊璐嘉，黃潔瑤，任 巧*，袁呂江*

西南大學藥學院，重慶 400715

研究枳實總黃酮對5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）誘導的腸黏膜炎和腸道菌群的影響及作用機制。雄性昆明小鼠隨機分為對照組、模型組及枳實總黃酮低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組和洛哌丁胺（0.3 mg/kg組），ip 5-FU（50 mg/kg）5 d誘導腸黏膜炎模型，第6天開始，各給藥組ig相應藥物，1次/d，連續7 d，觀察小鼠體質量、飲食量、飲水量、腹瀉評分、胸腺指數、脾臟指數、結腸形態、隱窩深度；采用蘇木素-伊紅（HE）染色考察小鼠結腸組織病理變化；采用ELISA法檢測小鼠結腸組織中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；檢測小鼠結腸組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）水平；采用細菌16S rRNA基因V3～4區高通量測序技術分析小鼠腸道菌群變化。與模型組相比，枳實總黃酮組小鼠體質量和飲食量增加，飲水量減少，腹瀉評分降低，胸腺指數和脾臟指數顯著增加（＜0.05、0.01），結腸組織損傷減輕，結腸長度和隱窩深度顯著增加（＜0.05、0.01），結腸組織中促炎細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低（＜0.05、0.01），SOD和GSH-Px活性顯著升高（＜0.05、0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01）。16S rRNA基因測序結果顯示，模型組小鼠腸道菌群多樣性和豐度降低，枳實總黃酮組小鼠腸道菌群多樣性和豐度增加。門水平主要表現為厚壁菌門相對豐度升高；屬水平上擬桿菌屬、unidentified_、擬普雷沃菌屬、unidentified_和乳酸桿菌屬5個菌屬相對豐度升高。枳實總黃酮能夠有效改善5-FU所致的小鼠腸黏膜炎，其機制可能與抗氧化、抗炎、調節腸道菌群有關。

枳實總黃酮；5-氟尿嘧啶；腸黏膜炎；腸道菌群；抗氧化；抗炎；蕓香柚皮苷；柚皮苷；橙皮苷

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是一種抗代謝藥物，為治療惡性腫瘤最常用的處方藥之一[1]。由于5-FU對DNA合成抑制的作用是非靶向性的，它不僅攻擊腫瘤細胞，還攻擊正常細胞，導致增殖抑制、DNA損傷和細胞死亡，引起廣泛的不良反應[2-3]。其中最嚴重的不良反應之一為腸黏膜炎并伴有嚴重腹瀉[4-5]。研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）[6]、炎性細胞因子[7-8]、細胞凋亡[9]以及腸道菌群失調是導致腸黏膜炎的主要因素[10-11]。50～80%接受5-FU治療的患者發展為腸黏膜炎或伴有嚴重腹瀉的黏膜炎[12-13]。目前治療腸黏膜炎和腸黏膜炎腹瀉的藥物大多是以對癥和短期治療為原則[14-15]。因此，開發安全有效的藥物對治療5-FU誘導的腸黏膜炎有重要意義。

枳實是酸橙L.及其栽培品種或甜橙Osbeck的干燥幼果，長期以來作為中藥單味或入制劑治療腹瀉、胃脹脹痛和子宮脫垂等胃腸道疾病[16]。黃酮類、生物堿、揮發油和香豆素是枳實的主要活性成分[17-18]。枳實中的揮發油成分具有抗真菌[19]、抗焦慮[20]和抗乙酰膽堿酯酶活性[21]；辛弗林和-甲基酪胺等生物堿類成分通常作為食品補充劑，可以減輕體質量并改善體態[22]；黃酮類成分中的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷具有抗氧化[23]、抗癌[24]、抗炎[25]、保護胃黏膜[26]、抗凝、調節腸道運動[27]、保護神經[28]等作用。然而，枳實黃酮類成分對化療誘導的腸黏膜炎的作用及機制少有報道。本研究從枳實中制備得到總黃酮，探究其對5-FU誘導的腸黏膜炎小鼠的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性昆明小鼠，體質量（20±2）g，8周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCKK（湘）2016-0002。動物在SPF級動物房中飼養，自由進食飲水，動物房溫度控制在（20±5）℃，濕度控制在（55±5）%，通風環境好，并且保持12 h明暗交替。動物實驗均根據《實驗動物的護理和使用指南》和《中國實驗動物立法》（第398-2006號）進行操作，并由西南大學實驗動物倫理審查委員會批準（批準號yxy201912）。

1.2 藥品與試劑

枳實（批號20190801）購自重慶市忠縣中藥有限公司，經西南大學藥學院李學剛教授鑒定為蕓香科植物酸橙L.；洛哌丁胺膠囊（批號H10910085）購自西安楊森制藥有限公司；5-FU注射液（批號H20051113）購自山西普德藥業有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為20190426、20190319、20190321）購自上海酶聯生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）試劑盒（批號分別為20190313、20190319、20190425）購自南京建成生物工程研究所；柚皮苷（批號Y-006-171216，質量分數≥98%）、蕓香柚皮苷（批號Y-071-170917，質量分數≥98%）、橙皮苷（批號C-006-170216，質量分數≥98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）；KQ5200DB型超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司）；QVSW-20A型超純水儀（美國Millipore公司）；RE-52A型旋轉蒸發儀（上海榮生化工儀器廠）；HHW-21CU-600B型恒溫水浴鍋（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；YP6000N型電子天平（上海精密儀器科技有限公司）；WK1000A型高速多功能粉碎機（山東青州市精誠機械有限公司）；TDL-5A型臺式低速大容量離心機（上海菲恰爾分析儀器）；ELX808型酶標分析儀（美國基因有限公司）；DY89型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SIM-FI40AY65型制冰機（日本松下電器）；OMYSS-325型全自動高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）；低溫微量高速離心機（重慶市醫療器械有限公司）；超凈工作臺（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 枳實總黃酮的制備

枳實總黃酮由本課題組采用低共熔溶劑（氯化膽堿/醋酸）進行超聲波輔助提取，利用大孔吸附樹脂富集分離技術對溶液中黃酮類成分富集分離，采用HPLC儀檢測枳實總黃酮中蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷的質量分數分別為3.36%、0.629%、15.96%。

2.2 造模、分組與給藥

小鼠適應性飼養1周后隨機分為對照組、模型組以及枳實總黃酮低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組和洛哌丁胺（0.3 mg/kg）組，每組10只。對照組ip 0.9%氯化鈉溶液，其余各組ip 5-FU（50 mg/kg）5 d誘導腸黏膜炎模型；從第6天開始，各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig 0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續7 d。自造模第1天起，每天記錄各組小鼠體質量、飲食量、飲水量、大便形狀及臨床表現，并對腹瀉狀態進行腹瀉評分，評分≥1的小鼠被認為是腹瀉，表現為自主活動減少、肛周污染、體質量減輕、糞便濕軟或呈水樣，評分為0表明小鼠大便正常，自主活動和體質量增加。

2.3 胸腺和脾臟指數的測定

各組小鼠于取材前1天（末次給藥后）禁食但不禁水12 h，樣本采集當天首先稱定小鼠體質量，小鼠ip 3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，采血后脫頸椎處死小鼠，緊靠心臟處取下胸腺，胃后面取下脾臟，濾紙吸去血跡，分別稱定質量。無菌條件下收集結腸中糞便并測量結腸長度，計算胸腺和脾臟指數。

胸腺（脾臟）指數＝胸腺（脾臟）質量/體質量

2.4 腸黏膜病理觀察

取約2 cm長的結腸段固定在4%甲醛溶液中，用石蠟包埋，切成4 μm切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學顯微鏡下觀察腸黏膜病理變化，評估結腸的病理變化，同時測量隱窩深度。

2.5 ELISA法測定結腸組織炎癥因子水平

按照ELISA試劑盒說明書檢測結腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.6 比色法測定結腸組織氧化應激指標

按照試劑盒說明書檢測結腸組織中SOD、GSH-Px活性和MDA水平。

2.7 腸道菌群測序

使用QIAamp DNA糞便Mini Kit從樣品中提取微生物DNA。用帶條形碼的特異引物（338F，806R）擴增細菌16S rRNA基因的區域（V3～4）。熱循環包括以下條件：98 ℃、2 min（1個循環）；95 ℃、30 s，50 ℃30 s，72 ℃、1 min（30個循環）；最后在72 ℃下延伸5 min。PCR產物的高通量測序在Illumina MiSeq平臺上進行高質量的生物信息學分析讀數，根據UCLUST，基于97%的序列相似性，每個樣品的所有有效讀數都被歸類為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。對于α多樣性分析，將OTU劃分為多個指標，包括OTU等級、稀釋曲線以及Shannon、Chao1、Simpson和ACE的計算指標。對于β多樣性分析，使用QIIME進行RDA識別的OTU熱圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）、非度量多維標度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和帶算術平均值的非加權對組方法（unweighted-pair- group method with arithmetic averag，UPGMA）。進行線性判別分析效應大?。↙EfSe）分析以定量分析各組之間的生物標志物。使用LEfSe分析，LDA閾值＞4，非參數階乘Kruskal-Wallis（KW）和秩檢驗，然后（不成對的）Wilcoxon秩和檢驗來識別差異最大的分類單元。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠腹瀉相關指標的影響

如圖1所示，對照組小鼠活動敏捷，體質量增加，飲食飲水正常，毛發光滑，無腹瀉情況。模型組小鼠出現腹瀉、扎堆、懶動、體質量減輕、飲食減少、飲水增加、翻毛和肛周污漬癥狀。各給藥組小鼠體質量和飲食增加、飲水減少，第12天各給藥組腹瀉評分接近正常，表明腹瀉基本好轉。第12天除模型組外，其余各組小鼠糞便基本正常，進一步說明枳實總黃酮明顯改善了5-FU誘導的小鼠腹瀉。

圖1 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠體質量 (A)、飲水量(B)、飲食量(C)、腹瀉評分(D) 和糞便外觀 (E) 的影響

3.2 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響

如圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠胸腺和脾臟指數顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，枳實總黃酮中、高劑量組和洛哌丁胺組小鼠胸腺和脾臟指數顯著增加（＜0.05、0.01），表明枳實總黃酮可以使腸黏膜炎小鼠胸腺和脾臟指數恢復至正常水平。

3.3 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠結腸形態和組織病理學的影響

如圖3-A、B所示，與對照組相比，模型組小鼠結腸長度顯著縮短（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組結腸長度顯著增加（＜0.05、0.01）。如圖3-C所示，模型組小鼠結腸組織隱窩深度顯著降低（＜0.01），各給藥組隱窩深度明顯恢復（＜0.01），表明枳實總黃酮可以恢復腸黏膜炎小鼠結腸長度，增加隱窩深度。如圖3-D所示，對照組小鼠基本沒有出現炎性細胞浸潤情況，隱窩結構保持完整且排列規則；模型組小鼠結腸組織中，上皮細胞壞死，隱窩結構被破壞，大量炎性細胞浸潤到黏膜層；與模型組相比，各給藥組腸上皮細胞、隱窩的形狀和分布得以恢復，表明枳實總黃酮可以修復5-FU誘導的結腸黏膜損傷，減輕腸道炎癥反應。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠結腸形態 (A)、結腸長度(B)、隱窩深度(C)和結腸組織病理變化(D) 的影響

3.4 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠結腸組織中炎癥因子水平的影響

如圖4所示，與對照組相比，模型組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著增加（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組結腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低（＜0.05、0.01），表明枳實總黃酮能夠調節腸黏膜炎小鼠結腸組織中炎癥因子水平。

3.5 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠結腸組織中SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響

如圖5所示，與對照組相比，各造模組小鼠結腸組織中SOD和GSH-Px活性顯著降低（＜0.01），MDA水平顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，洛哌丁胺組結腸組織中GSH-Px活性顯著升高（＜0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01）；枳實總黃酮各劑量組結腸組織中SOD和GSH-Px活性顯著升高（＜0.05、0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01），表明枳實總黃酮可以改善腸黏膜炎小鼠的氧化應激參數。

3.6 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠腸道菌群整體結構的影響

如圖6-A所示，每個樣品的平均有效序列為77 099條，各組之間的DNA序列無顯著差異。分析表明，盡管通過更高的測序覆蓋率可以獲得新的系統，但每個樣品中的腸道菌群多樣性大都可以在當前測序深度下得到充分捕獲（圖6-B）。Illumina Hiseg測序系統產生了929個可操作分類單位，相似度截止為97%。組間OTU重疊表明，6組共有455個相同的OTU，對照組、模型組、洛哌丁胺組以及枳實總黃酮低、中、高劑量組分別有14、11、28、18、9、4個獨立的OUT（圖6-C）。與對照組相比，模型組OTU數量略有減少；與模型組相比，枳實總黃酮中劑量組OUT數量明顯增加，枳實總黃酮低、高劑量組對OUT數量沒有產生影響（圖6-D）。OUT數據表明，通過枳實總黃酮中劑量可以恢復腸道菌群的多樣性。

圖4 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

圖5 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠結腸組織中SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響

A-每個糞便樣品的質量序列均低于97%一致性閾值 B-反光分析 C-OTU維恩圖 D-各組OUT E-PCA散點圖 F-NMDS散點圖 G-Chao1指數 H-ACE指數 I-Simpson指數 J-Shannon指數

為了闡明不同群體之間微生物群結構變化，進行β多樣性分析包括PCA和NMDS。如圖6-E所示，PC1和PC2變化的百分比分別為18.85%和12.46%，模型組與其他5組樣本相距較遠，枳實總黃酮各劑量組較洛哌丁胺組更接近對照組，NMDS分析也觀察到同樣的結果（圖6-F）。如圖6-G～J所示，與對照組比較，模型組小鼠Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，枳實總黃酮中劑量組Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數顯著升高（＜0.05），洛哌丁胺組Chao1、ACE、Simpson和Shannon指數顯著降低（＜0.05）。

綜上，5-FU通過減少微生物群落豐富度和多樣性改變了腸道菌群的整體結構，枳實總黃酮中劑量有效地恢復了腸道菌群的整體結構，洛哌丁胺使腸道微生物的豐富性和多樣性的降低，使得腸道菌群的整體結構進一步惡化。

3.7 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠腸道菌群的影響

如圖7所示，在門水平上，擬桿菌門、厚壁菌門和變形桿菌門是各組的主要菌門。擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門、unidentified_Bacteria和放線菌門相對豐度分別為58.31%、34.52%、1.45%、4.10%和1.00%，占總豐度的99.38%。與對照組比較，模型組擬桿菌門和變形桿菌門分別增加至65.70%和3.67%，厚壁菌門和放線菌門分別減少至26.21%和0.37%；洛哌丁胺組及枳實總黃酮低、中劑量組厚壁菌門相對豐度分別恢復到31.70%、29.54%、37.86%。與對照組比較，模型組厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，洛哌丁胺組及枳實總黃酮低、中劑量組F/B顯著升高（＜0.05、0.01）。

如圖8所示，在屬水平上，對照組擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬、乳酸桿菌屬、unidentified_、、unidentified_、副擬桿菌屬、幽門螺桿菌屬、相對豐度分別為10.47%、10.56%、7.03%、0.32%、2.50%、2.64%、2.12%、3.65%、0.07%，占總豐度的39%以上；與對照組相比，模型組擬桿菌屬、unidentified_、相對豐度分別增加到32.7%、1.69%、0.56%，擬普雷沃菌屬、乳酸桿菌屬、、unidentified_相對豐度分別降低到5.33%、6.07%、0.90%、0.96%。與模型組相比，各給藥組擬桿菌屬相對豐度降低，枳實總黃酮低、中劑量組unidentified_相對豐度降低；陽性藥組和枳實總黃酮高劑量組擬普雷沃菌屬相對豐度增加，枳實總黃酮高劑量組的乳酸桿菌屬相對豐度升高。表明5-FU導致了明顯的腸道菌群失調，枳實總黃酮可以有效地改善腸道菌群失調情況。

圖7 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠腸道菌群門水平相對豐度的影響

圖8 枳實總黃酮對腸黏膜炎小鼠腸道菌群屬水平相對豐度的影響

4 討論

本研究結果表明，小鼠給予5-FU后，體質量嚴重降低，腹瀉、飲食減少，飲水增加，皮毛松弛，懶動；枳實總黃酮可顯著改善腸黏膜炎小鼠的一般狀態，表明枳實總黃酮可以改善5-FU引起的不良反應[29]；枳實總黃酮可以恢復腸黏膜炎小鼠的結腸長度，改善隱窩萎縮，抑制炎癥因子水平，表明枳實總黃酮對結腸形態和黏膜具有保護作用；枳實總黃酮能夠通過改善胸腺指數和脾臟指數恢復了腸黏膜炎小鼠受損的免疫功能。綜上所述，枳實總黃酮可有效減輕5-FU引起的腸道不良反應，與文獻報道一致[30-31]。

ROS、DNA、蛋白質和細胞膜相互作用以調節信號通路，通過產生促炎細胞因子導致組織破壞和炎癥反應。5-FU通過抑制內源性抗氧化劑（如SOD、過氧化氫酶、GSH、GSH-Px）活性及升高MDA和促炎細胞因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6）水平，誘導腸黏膜炎[32]。本研究發現，小鼠給予5-FU后，結腸組織中SOD和GSH-Px活性降低，MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高；枳實總黃酮能夠提高SOD和GSH-Px活性，抑制MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。因此，枳實總黃酮能夠通過抗氧化和抗炎來治療5-FU誘導的腸黏膜炎。

5-FU干擾腸道微生物群落。通過16S rDNA擴增測序技術分析了各組小鼠糞便樣本中的微生物群。結果表明，5-FU造模后小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性顯著降低，從而腸道菌群的整體結構發生改變；枳實總黃酮中劑量組通過增加豐富度和多樣性將腸道微生物群的整體結構調節到正常水平。

在門水平上，模型組小鼠腸道厚壁菌門相對豐度降低，擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度增加，F/B降低；枳實總黃酮使腸道厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度降低，從而提高F/B。由于厚壁菌和變形桿菌是糞便相關菌，而擬桿菌被認為是黏膜相關菌，它們的豐度變化最有可能引發細菌感染和胃腸道疾病如腹瀉和腸炎[33]。F/B是評估腸易激綜合征[34]、炎癥性腸病[35]和代謝紊亂[36]等腸病患者的常用指標。

在屬水平上，模型組小鼠腸道擬桿菌屬、unidentified_和相對豐度顯著增加，而擬普雷沃菌屬、乳酸桿菌屬、和unidentified_相對豐度顯著降低。擬桿菌是與5-FU治療相關的重要病原菌之一，一些梭狀芽孢桿菌如肉毒梭菌，由于產生外毒素而被認為是致病菌。益生菌乳桿菌可以改善5-FU引起的腸道損傷和生態失調[37]。瘤胃球菌通過產生丁酸鹽為腸上皮細胞提供必需的能量，以提高腸道免疫力[38]。枳實總黃酮能夠抑制潛在致病菌并促進了糞便中的益生菌，從而改善5-FU誘導的腸道微生物群失調。

枳實總黃酮的黏膜保護作用、枳實總黃酮中活性成分與腸道微生物群之間的具體關系仍待進一步確定。一是糞便群落不能完全代表生活在腸道中的細菌群落[39]；二是當枳實總黃酮調節腸道微生物群的整體結構時，其黏膜保護作用和成分可能會受到腸道微生物代謝和藥動學的影響[40]。例如，在枳實總黃酮中分別占15.45%、39.19%的柚皮苷和橙皮苷對人體腸道微生物群（半乳糖擬桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、鏈狀雙歧桿菌、布氏瘤胃球菌、大腸桿菌）沒有表現出體外抑制活性，但苷元缺表現出體外抑制活性[41]。因此，枳實總黃酮活性成分和腸道微生物群變異之間關系的系統和全面解釋將是本課題組后續研究的重點。

綜上所述，枳實總黃酮可以通過抑制氧化應激、抑制促炎細胞因子分泌并調節腸道微生物群的整體結構和組成，有效減輕5-FU誘導的腸黏膜炎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Ducreux M, Bennouna J, Hebbar M,. Capecitabine plus oxaliplatin (XELOX) versus 5-fluorouracil/ leucovorin plus oxaliplatin (FOLFOX-6) as first-line treatment for metastatic colorectal cancer [J]., 2011, 128(3): 682-690.

[2] Longley D B, Harkin D P, Johnston P G. 5-Fluorouracil: Mechanisms of action and clinical strategies [J]., 2003, 3(5): 330-338.

[3] Miura K, Kinouchi M, Ishida K,. 5-Fu metabolism in cancer and orally-administrable 5-fu drugs [J].(Basel), 2010, 2(3): 1717-1730.

[4] Zhang S, Liu Y, Xiang D,. Assessment of dose-response relationship of 5-fluorouracil to murine intestinal injury [J]., 2018, 106: 910-916.

[5] Daniele B, Secondulfo M, De Vivo R,. Effect of chemotherapy with 5-fluorouracil on intestinal permeability and absorption in patients with advanced colorectal cancer [J]., 2001, 32(3): 228-230.

[6] dos Santos Filho E X, ávila P H M, Bastos C C C,. Curcuminoids fromlonga L. reduced intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice: Bioadhesive, proliferative, anti-inflammatory and antioxidant effects [J]., 2016, 3: 55-62.

[7] Sonis S T, Elting L S, Keefe D,. Perspectives on cancer therapy-induced mucosal injury: Pathogenesis, measurement, epidemiology, and consequences for patients [J]., 2004, 100(9 Suppl): 1995-2025.

[8] Lee C S, Ryan E J, Doherty G A. Gastro-intestinal toxicity of chemotherapeutics in colorectal cancer: The role of inflammation [J]., 2014, 20(14): 3751-3761.

[9] Hamouda N, Sano T, Oikawa Y,. Apoptosis, dysbiosis and expression of inflammatory cytokines are sequential events in the development of 5-fluorouracil- induced intestinal mucositis in mice [J]., 2017, 121(3): 159-168.

[10] Von Bültzingsl?wen I, Adlerberth I, Wold A E,. Oral and intestinal microflora in 5-fluorouracil treated rats, translocation to cervical and mesenteric lymph nodes and effects of probiotic bacteria [J]., 2003, 18(5): 278-284.

[11] van Vliet M J, Harmsen H J, de Bont E S,. The role of intestinal microbiota in the development and severity of chemotherapy-induced mucositis [J]., 2010, 6(5): e1000879.

[12] Iacovelli R, Pietrantonio F, Palazzo A,. Incidence and relative risk of grade 3 and 4 diarrhoea in patients treated with capecitabine or 5-fluorouracil: A meta- analysis of published trials [J]., 2014, 78(6): 1228-1237.

[13] Stein A, Voigt W, Jordan K. Review: Chemotherapy-induced diarrhea: Pathophysiology, frequency and guideline-based management [J]., 2010, 2(1): 51-63.

[14] Benson A B, Ajani J A, Catalano R B,. Recommended guidelines for the treatment of cancer treatment-induced diarrhea [J]., 2004, 22(14): 2918-2926.

[15] Gibson R J, Keefe D M K, Lalla R V,. Systematic review of agents for the management of gastrointestinal mucositis in cancer patients [J]., 2013, 21(1): 313-326.

[16] Kurita A, Kado S, Kaneda N,. Modified irinotecan hydrochloride (CPT-11) administration schedule improves induction of delayed-onset diarrhea in rats [J]., 2000, 46(3): 211-220.

[17] Liu W Y, Zhou C, Yan C M,. Characterization and simultaneous quantification of multiple constituents inextracts by HPLC-DAD- ESI-MS/MS [J]., 2012, 10(6): 456-463.

[18] 張霄瀟, 李正勇, 馬玉玲, 等. 中藥枳實的研究進展 [J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(2): 185-190.

[19] Viuda-Martos M, Ruiz-Navajas Y, Fernández-López J,. Antifungal activity of lemon (L.), mandarin (L.), grapefruit (L.) and orange (L.) essential oils [J]., 2008, 19(12): 1130-1138.

[20] de Moraes Pultrini A, Almeida Galindo L, Costa M. Effects of the essential oil fromL. in experimental anxiety models in mice [J]., 2006, 78(15): 1720-1725.

[21] Zarrad K, Hamouda A B, Chaieb I,. Chemical composition, fumigant and anti-acetylcholinesterase activity of the TunisianL. essential oils [J]., 2015, 76: 121-127.

[22] Fugh-Berman A, Myers A., an ingredient of dietary supplements marketed for weight loss: Current status of clinical and basic research [J].(Maywood), 2004, 229(8): 698-704.

[23] Yu J, Wang L, Walzem R L,. Antioxidant activity oflimonoids, flavonoids, and coumarins [J]., 2005, 53(6): 2009-2014.

[24] Manthey J A, Guthrie N. Antiproliferative activities offlavonoids against six human cancer cell lines [J]., 2002, 50(21): 5837-5843.

[25] Kim J A, Park H S, Kang S R,. Suppressive effect of flavonoids from KoreanL. on the expression of inflammatory mediators in L6 skeletal muscle cells [J]., 2012, 26(12): 1904-1912.

[26] Takase H, Yamamoto K, Hirano H,. Pharmacological profile of gastric mucosal protection by marmin and nobiletin from a traditional herbal medicine, Aurantii fructus immaturus [J]., 1994, 66(1): 139-147.

[27] Tan W, Li Y, Wang Y,. Anti-coagulative and gastrointestinal motility regulative activities ofand its effective fractions [J]., 2017, 90: 244-252.

[28] Nakajima A, Yamakuni T, Haraguchi M,. Nobiletin, aflavonoid that improves memory impairment, rescues bulbectomy-induced cholinergic neurodegeneration in mice [J]., 2007, 105(1): 122-126.

[29] Atiq A, Shal B, Naveed M,. Diadzein ameliorates 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis by suppressing oxidative stress and inflammatory mediators in rodents [J]., 2019, 843: 292-306.

[30] Wang J, Feng W, Zhang S,. Ameliorative effect ofessential oil combined withtotal saponins on 5-fluorouracil induced diarrhea is associated with gut microbial modulation [J]., 2019, 238: 111887.

[31] Wang J, Feng W, Zhang S,. Gut microbial modulation in the treatment of chemotherapy-induced diarrhea with Shenzhu Capsule [J]., 2019, 19(1): 126.

[32] Ali J, Khan A U, Shah F A,. Mucoprotective effects of saikosaponin-A in 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice model [J]., 2019, 239: 116888.

[33] Rangel I, Sundin J, Fuentes S,. The relationship between faecal-associated and mucosal-associated microbiota in irritable bowel syndrome patients and healthy subjects [J]., 2015, 42(10): 1211-1221.

[34] Louis S, Tappu R M, Damms-Machado A,. Characterization of the gut microbial community of obese patients following a weight-loss intervention using whole metagenome shotgun sequencing [J]., 2016, 11(2): e0149564.

[35] Rojas-Feria M, Romero-García T, Fernández Caballero- Rico J á,. Modulation of faecal metagenome in Crohn’s disease: Role of microRNAs as biomarkers [J]., 2018, 24(46): 5223-5233.

[36] Yakoob J, Abbas Z. Role of Omega-3 fatty acids in irritable bowel syndrome (IBS) [J]., 2016, 6(8): 271-277.

[37] Tang Y, Wu Y, Huang Z,. Administration of probiotic mixture DM#1 ameliorated 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis and dysbiosis in rats [J]., 2017, 33: 96-104.

[38] Leonel A J, Alvarez-Leite J I. Butyrate: Implications for intestinal function [J]., 2012, 15(5): 474-479.

[39] Liu S, da Cunha A P, Rezende R M,. The host shapes the gut microbiota via fecal MicroRNA [J]., 2016, 19(1): 32-43.

[40] Feng W, Ao H, Peng C,. Gut microbiota, a new frontier to understand traditional Chinese medicines [J]., 2019, 142: 176-191.

[41] Duda-Chodak A. The inhibitory effect of polyphenols on human gut microbiota [J]., 2012, 63(5): 497-503.

Effect of total flavonoids fromon intestinal flora imbalance in mice with intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil

LIU Dan-ning, PAN Meng-xue, YANG Lu-jia, HUANG Jie-yao, REN Qiao, YUAN Lyu-jiang

College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

To study the effect and mechanism of total flavonoids from Zhishi (, AFIF) on mice with intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil (5-FU).Male Kunming mice were randomly divided into control group, model group, low-, medium- and high-dose AFIF (50, 100, 200 mg/kg) groups and loperamide (0.3 mg/kg) group. 5-FU (50 mg/kg) was injected intraperitoneally for 5 d to induce intestinal mucositis model. Beginning on day 6, rats in each administration group were ig corresponding drugs, once a day for 7 consecutive days. The body weight, diet intake, water intake, diarrhea score, thymus index, spleen index, colon morphology and crypt depth were observed. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to investigate the pathological changes of colon. Levels of interlerkin-6 (IL-6), IL-1β and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in colon tissues were determined by ELISA; Superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) activities, and malondialdehyde (MDA) level were detected; 16S rRNA gene V3—4 regions for high throughput sequencing technology was used to analysis the changes of intestinal flora.Compared with model group, body weight and food intake of mice in AFIF groups were increased, water intake and diarrhea score were decreased, thymus and spleen index were significantly increased (< 0.05, 0.01), colon tissue damage was reduced, colon length and crypt depth were significantly increased (< 0.05, 0.01); Levels of pro-inflammatory cytokines IL-6, IL-1β and TNF-α in colon tissue were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Activities of SOD and GSH-Px were significantly increased (< 0.05, 0.01), and MDA level was significantly decreased (< 0.01). 16S rRNA gene sequencing results showed that diversity and abundance of intestinal flora of mice in model group was reduced, diversity and abundance of intestinal flora of mice in AFIF groups were increased. At phylum level, the relative abundance of Firmicutes was increased in AFIF groups. At genus level, the relative abundance of, unidentified_,, unidentified_andwere increased.AFIF can effectively improve 5-FU induced intestinal mucositis in mice, and its mechanism may be related to the anti-oxidation, anti-inflammatory and regulation of intestinal flora.

total flavonoids from; 5-fluorouracil; intestinal mucositis; intestinal flora; anti-oxidant; anti-inflammatory; narirutin; naringin; hesperidin

R285.5

A

0253 - 2670(2021)23 - 7204 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.014

2021-08-16

重慶科委社會事業與民生保障科技創新專項（cstc2017shmsA10004）

劉丹寧（1993—），女，碩士研究生，主要從事中藥活性成分研究。E-mail: 2427817565@qq.com

袁呂江，教授，碩士生導師，主要從事中藥活性成分研究。E-mail: yuanlujiang@hotmail.com

任 巧，副教授，碩士生導師，主要從事中藥活性成分研究。E-mail: qren2014@swu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]