TLR4、MyD88、NF-κB在乙型肝炎病毒肝硬化患者中的表達及其臨床意義

馬良，趙陽，伍華英，徐偉，苗滸

（華北石油管理局總醫(yī)院1.感染性疾病科，2.老年醫(yī)學(xué)科，3.血液內(nèi)分泌科，4.醫(yī)學(xué)檢驗科，5.醫(yī)務(wù)科，河北 滄州062552）

乙型肝炎病毒是一類嗜肝DNA 病毒，流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球范圍內(nèi)，約有3 億人感染或攜帶HBV，且高發(fā)于亞洲和非洲[1]。有研究報道，中國約有2 300 萬慢性乙型肝炎患者，而乙型肝炎病毒感染人數(shù)則高達1.3 億[2]。乙型肝炎病毒感染人體后，機體會產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答，一方面可控制病毒的復(fù)制，清除病毒，促使部分患者病情得到緩解甚至康復(fù)；另一方面，抗病毒免疫應(yīng)答會誘使機體發(fā)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致部分患者肝臟受到損傷或壞死，甚至進展為肝硬化或肝癌[3-4]。對大多數(shù)兒童和部分成年人則難以有效清除病毒或控制病毒的發(fā)展，進而表現(xiàn)為病毒攜帶者或慢性肝炎，而約10%～30%的患者會發(fā)展為肝硬化或肝癌[5-6]。因此分析肝硬化的發(fā)病機制，探討有效的診斷指標(biāo)具有十分重要的臨床意義。乙型肝炎病毒感染所致的不同臨床轉(zhuǎn)歸與病毒和宿主免疫系統(tǒng)之間的作用存在密切聯(lián)系。Toll樣受體4（toll-like receptor 4,TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）、核轉(zhuǎn)錄因子-κ（nuclear factor-kappa B, NF-κB）信號通路廣泛存在于機體各個組織細(xì)胞中，是疾病發(fā)生、發(fā)展過程中重要通路，可介導(dǎo)炎癥因子在細(xì)胞中的表達[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、MyD88、NF-κB信號通路與肝免疫異常、炎癥反應(yīng)所致的肝損傷、肝星狀細(xì)胞的活化及肝纖維化、肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。基于此，本研究通過探討肝硬化中TLR4、MyD88、NF-κB 信號通路的表達及其在診斷預(yù)后中的臨床價值，旨在為臨床診治肝硬化及評價預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2019年1月華北石油管理局總醫(yī)院收治的130 例乙型肝炎肝硬化患者為研究對照（肝硬化組），選擇同期130 例乙型肝炎患者為乙肝組，130 例健康人群為對照組。其中肝硬化組根 據(jù)ChildPugh 分 級[11]：A 級49 例，B 級47 例，C 級34 例；根據(jù)肝硬化程度分為：代償期肝硬化49 例，失代償期肝硬化48 例，原發(fā)性肝癌33 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①肝硬化組及乙肝組患者需符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2015 更新版）》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；②原發(fā)性肝癌患者需符合中華人民共和國衛(wèi)生部制定的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[13]；③納入研究對象及其家屬知情且同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往手術(shù)史者；②非乙型肝炎病毒因素所致肝硬化者；③合并嚴(yán)重其他疾病者；④精神狀態(tài)異常或依從性差者。

1.3 觀察指標(biāo)

所有研究對象于入組次日清晨空腹抽取靜脈血5 ml×3 管。一管采用AU 5800 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）水平；一管采用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）分離單核細(xì)胞并檢測其表面TLR4 陽性率。一管以3 000 r/min 離心5 min，分離血清。采用microlab star 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Hamilton公司）進行酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測MyD88 和NF-κB水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，組間進一步兩兩比較，若方差齊性，采用LSD-t檢驗，若方差不齊，采用Dunnett-t檢驗；相計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關(guān)分析用Pearson 法，繪制ROC 曲線，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較

肝硬化組、乙型肝炎組、對照組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；3 組ALT、AST 及TBIL 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），肝硬化組和乙型肝炎組各指標(biāo)水平均高于對照組（P<0.05）；肝硬化組各指標(biāo)水平均高于乙型肝炎組（P<0.05）。見表1。

表1 3組一般資料比較 （n=130）

2.2 3組TLR4、MyD88、NF-κB水平比較

肝硬化組、乙型肝炎組、對照組TLR4、MyD88、NF-κB 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），肝硬化組和乙型肝炎組各指標(biāo)水平均高于對照組（P<0.05）；肝硬化組各指標(biāo)水平均高于乙型肝炎組（P<0.05）。見表2。

表2 3組TLR4、MyD88、NF-κB水平比較（n=130，±s）

表2 3組TLR4、MyD88、NF-κB水平比較（n=130，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與乙肝組比較，P<0.05。

組別肝硬化組乙型肝炎組對照組F 值P 值TLR4/%30.45±7.69①②19.27±6.52①10.14±2.26 378.018 0.000 MyD88/（pg/ml）913.26±164.89①②721.98±112.83①532.43±81.56 303.634 0.000 NF-κB/（pg/ml）1 208.45±152.73①②892.61±139.84①692.48±114.87 470.642 0.000

2.3 不同級別ChildPugh 肝硬化患者TLR4、MyD88、NF-κB水平比較

ChildPugh A 級、ChildPugh B 級和ChildPugh C 級患者TLR4、MyD88、NF-κB 水平的比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），ChildPugh C 級患者各指標(biāo)水平均高于ChildPugh B 級患者（P<0.05），ChildPugh B級患者各指標(biāo)水平均高于ChildPugh A 級患者。見表3。

表3 不同級別ChildPugh肝硬化患者TLR4、MyD88、NF-κB水平比較 （±s）

表3 不同級別ChildPugh肝硬化患者TLR4、MyD88、NF-κB水平比較 （±s）

注：①與ChildPugh A級比較，P<0.05；②與ChildPugh B級比較，P<0.05。

組別ChildPugh A級ChildPugh B級ChildPugh C級F 值P 值n 49 47 34 TLR4/%21.92±3.21 30.03±5.94①37.94±7.72①②237.900 0.000 MyD88/（pg/ml）773.86±128.37 921.17±138.23 1 053.12±152.13①②129.599 0.000 NF-κB/（pg/ml）939.36±113.99 1 215.42±144.89①1 319.49±155.58①②258.627 0.000

2.4 不同程度肝硬化患者TLR4、MyD88、NF-κB水平比較

代償期、失代償期和原發(fā)性肝癌患者TLR4、MyD88 及NF-κB 水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），原發(fā)性肝癌患者各指標(biāo)水平高于失代償期患者（P<0.05），失代償期患者各指標(biāo)水平高于代償期患者。見表4。

表4 不同程度肝硬化患者TLR4、MyD88、NF-κB水平比較 （±s）

表4 不同程度肝硬化患者TLR4、MyD88、NF-κB水平比較 （±s）

注：①與代償期比較，P<0.05；②與失代償期比較，P<0.05。

組別代償期失代償期原發(fā)性肝癌F 值P 值n 49 48 33 TLR4/%21.38±3.57 29.17±5.34①37.96±7.51①②274.777 0.000 MyD88/（pg/ml）773.94±134.99 921.45±123.31①1 052.45±152.58①②133.521 0.000 NF-κB/（pg/ml）938.14±125.35 1 215.81±143.24①1 319.34±156.30①②249.812 0.000

2.5 肝硬化患者TLR4、MyD88、NF-κB 與Child Pugh分級、AST、ALT、及TBIL的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TLR4、MyD88、NF-κB與Child Pugh 分級、ALT、AST 及TBIL 均呈正相關(guān)（P<0.05）。見表5。

表5 肝硬化患者TLR4、MyD88、NF-κB與Child Pugh分級、AST、ALT及TBIL的相關(guān)性

2.6 血清各指標(biāo)預(yù)測肝硬化致原發(fā)性肝癌的ROC曲線結(jié)果

繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，當(dāng)ALT 截斷值為101.44 u/L時，AUC為0.738；AST截斷值為136.74 u/L時，AUC 為0.706；TBIL 截斷值為51.86 μmol/L 時，AUC 為0.746；TLR4 截斷值為32.342%時，AUC 為0.896；MyD88截斷值為931.402 pg/ml 時，AUC 為0.897；NF-κB 截斷值為1 243.620 pg/ml 時，AUC 為0.875。見圖1和表6。

表6 血清各指標(biāo)預(yù)測肝硬化轉(zhuǎn)原發(fā)性肝癌的ROC曲線結(jié)果

圖1 血清各指標(biāo)預(yù)測肝硬化致原發(fā)性肝癌的ROC曲線

3 討論

近年來，隨著社會發(fā)展，乙型肝炎病毒感染已呈全球流行趨勢，且在我國為主要感染性疾病之一。由于乙型肝炎病毒可在患者體內(nèi)長期復(fù)制，導(dǎo)致機體處于“循環(huán)壞死和再生修復(fù)”的惡性循環(huán)中，進而促使肝細(xì)胞的纖維化，最終發(fā)展為肝硬化，而處于此階段的患者若未得到及時發(fā)現(xiàn)及治療，肝細(xì)胞纖維化過程將進一步發(fā)展，并重復(fù)壞死和修復(fù)過程，導(dǎo)致患者發(fā)展為失代償期肝硬化甚至原發(fā)性肝癌，而這一過程往往是不可逆的[14-16]。因此如何有效預(yù)防和阻止乙型肝炎病毒感染患者發(fā)展為肝硬化是醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注重點。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機體受到病原體感染時，天然免疫系統(tǒng)可通過特殊的識別系統(tǒng)殺傷或殺死病原體，因此這一過程被認(rèn)為機體的“第一道防線”。已有研究證實，Toll 樣受體在天然免疫系統(tǒng)識別并殺死病原體過程中發(fā)揮重要作用[17-18]。Toll 樣受體是一類天然免疫受體，并可對不同病原相關(guān)分子模式（PAMPs）進行識別、結(jié)合，從而進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進炎癥介質(zhì)的釋放。Toll 樣受體廣泛存在于機體的多種免疫細(xì)胞（B 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞等）或組織（外周血白細(xì)胞、脾臟等）中，并與多種免疫系統(tǒng)疾病、炎癥疾病或感染性疾病密切相關(guān)[19-20]。

TLR4 為Toll 樣受體家族中的一員，其可識別多種PAMPs 從而發(fā)揮其免疫作用。肝硬化的發(fā)生發(fā)展育乙型肝炎病毒等病原體的感染密切相關(guān)，乙型肝炎病毒感染肝臟細(xì)胞后，會以PAMPs 的形式被識別。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、MyD88、NF-κB 信號通路在乙型肝炎病毒相關(guān)肝臟疾病中具有重要意義[21]。TLR4 通過介導(dǎo)MyD88 從而參與肝臟病理反應(yīng)，患者機體中的損傷因子和脂多糖可促發(fā)TLR4信號，進而激活其下游信號MyD88，從而促進肝組織炎癥因子、趨化因子的釋放。MyD88 不僅是TLR4 的轉(zhuǎn)接蛋白，也是NF-κB 的連接蛋白，當(dāng)炎癥信號通過TLR4 傳遞給MyD88 后，MyD88 促使IRAK4 的磷酸化，而磷酸化的IRAK4 進一步作用于TAB-1/TAB-2，促使TAK-1 的激活，活化的TAK-1作用于NF-κB，導(dǎo)致IκB 激酶的活化，IκB 激酶則促進IκB 磷酸化的激活，進而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的釋放，而釋放的炎癥因子又可促進NF-κB 的激活，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致肝細(xì)胞的持續(xù)受損[22]。本研究結(jié)果顯示，相較于正常人群，肝硬化和乙型肝炎患者TLR4、MyD88、NF-κB 水平均呈過表達，且肝硬化各指標(biāo)水平更高。研究進一步比較了肝硬化患者不同ChildPugh 分級或病情嚴(yán)重程度中TLR4、MyD88、NF-κB 的表達情況，結(jié)果顯示，隨著ChildPugh 分級的增加或病情的加重，患者TLR4、MyD88、NF-κB 水平均有所上升，且TLR4、MyD88、NF-κB 水平與ChildPugh 分級、ALT、AST及TBIL 均呈正相關(guān)，提示TLR4、MyD88、NF-κB信號通路與乙型肝炎病毒所致肝炎及肝硬化病理進程密切相關(guān)。

肝臟活檢來對病情進行診斷和分期為目前臨床檢驗的金標(biāo)準(zhǔn)[23]。但該技術(shù)也存在一定不足：一方面，患者取樣區(qū)域往往受到病理醫(yī)生的主觀影響，這將導(dǎo)致檢驗結(jié)果可能存在偏差；另一方面，活檢往往難以長期監(jiān)測或評估慢性患者的病情及病程，因此無法為患者提供動態(tài)資料[24]。因此，近年來，通過生物標(biāo)志物的檢測來對肝硬化患者的診斷及評估預(yù)后已成為臨床關(guān)注重點。本研究也探討了上述指標(biāo)在診斷肝硬化轉(zhuǎn)原發(fā)性肝癌的臨床價值。結(jié)果顯示，ALT、AST 及TBIL 診斷肝硬化轉(zhuǎn)肝癌中臨床價值一般，而TLR4、MyD88、NF-κB在診斷肝硬化轉(zhuǎn)肝癌中均具有一定臨床價值（AUC>0.700），這也提示可將其作為評估預(yù)后的指標(biāo)之一。

綜上所述，TLR4、MyD88、NF-κB 信號通路與乙型肝炎病毒所致肝炎及肝硬化病理進程密切相關(guān)，且TLR4、MyD88、NF-κB 的檢測在診斷肝硬化轉(zhuǎn)原發(fā)性肝癌中具有一定臨床價值。但本研究也存在樣本量較小、未動態(tài)觀察各指標(biāo)變化情況等不足，因此仍需后續(xù)研究加以證實。