MicroRNA-181a、SIRT1水平與新生兒急性呼吸窘迫綜合征嚴重程度及預后的相關性*

林勇，束國防，陳名霞，孫曉玄，陸愛珍

（1.東南大學附屬中大醫院江北院區 兒科，江蘇 南京210044；2.東南大學附屬中大醫院檢驗科，江蘇 南京210003；3.東南大學附屬中大醫院江北院區 檢驗科，江蘇 南京210044；4.復旦大學附屬兒科醫院 呼吸科，上海201102）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是肺部或全身性損害因素引起廣泛急性炎癥性肺損傷導致的肺力學異常和氣體交換障礙，為新生兒重癥監護室（neonatal intensive care unit, NICU）常見危重癥[1]。盡管產前皮質類固醇、表面活性劑、高級呼吸護理等方式極大改善新生兒ARDS 的預后，但ARDS 仍然是新生兒死亡的重要原因之一，因此早期評估患兒預后意義重大[2]。炎癥反應失控是ARDS 發生、發展的重要病理生理機制之一[3]。MicroRNA 是一種非編碼小分子RNA，參與了多種細胞因子轉錄調控，能通過影響靶基因表達調控炎癥通路，在炎癥反應進展中扮演重要角色[4]。有研究報道[5]，脂多糖誘導的急性肺損傷中microRNA-181a（miR-181a）能通過調節核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信號通路參與急性肺損傷過程中的過度失控性炎癥反應。沉默信息調節因子2 相關酶1（silent information regulator factor 2-related enzyme 1, SIRT1）為Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，SIRT1 表達下調能通過激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 促進急性肺損傷的炎癥反應。目前尚無研究報道miR-181a 和SIRT1 與ARDS新生兒病情嚴重程度和預后的關系。本研究分析ARDS 新生兒血清miR-181a、SIRT1 水平變化，探討兩者與病情嚴重程度及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月—2021年7月東南大學附屬中大醫院江北院區收治的162 例ARDS 患兒為ARDS組。其中，男性92 例，女性70 例；日齡1～7 d，平均（4.18±1.08）d；體重1 200～4 000 g，平均（3 000.82±253.15） g；致病原因：膿毒癥17 例、早產48 例、肺炎40 例、胎糞吸入39 例、其他原因18 例。納入標準：①符合《“新生兒急性呼吸窘迫綜合征”蒙特勒標準（2017年版）》[6]診斷標準；②明確或可疑臨床損傷后出現的急性發作≤7 d；③患兒家屬或監護人知情同意。排除標準：①先天性畸形、新生兒暫時性呼吸增快癥引起的呼吸困難；②肺腺瘤樣畸形、膈疝、表面活性物質相關的遺傳性缺陷；③羊水吸入綜合征；④腦性過度換氣；⑤嚴重肝腎功能障礙；⑥臨床資料不全。另選取同期64 名健康新生兒為對照組，其中，男性36 例，女性28 例；日齡1～7 d，平均（4.26±1.21）d；體重2 500～4 000 g，平均（3 048.18±246.58）g。兩組性別、日齡、體重比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 血清miR-181a mRNA相對表達量、SIRT1和炎癥因子水平檢測

分別于ARDS 組入NICU 后24 h 內、對照組次日清晨采集股靜脈血3 ml，3 000 r/min 離心10 min（半徑8 cm），取上清液，分為2 份，置于-80℃冰箱中冷凍保存待檢。一份血清標本用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR），Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計驗證純度，OD260/OD280 為1.8～2.0，qRT-PCR 擴增。miR-181a 引物：正向5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3'， 反向5'-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUUU-3'；內參U6引物：正向5'-AGCATGCTAGCTAGCGTGAATGA-3'，反向5'-GTAGCGCTAGATGCATGCCATCA-3'。反應體系（共10.0 μl）：5.0 μl SYBR Premix Ex Taq，0.2 μl正向引物，0.2 μl 反向引物，0.2μl ROX Reference Dye，1.0 μl cDNA 模板，3.4 μl RNase-free ddH2O。反應條件：95℃預變性90 s（1 個循環）、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，40 個循環。反應結束后得到各反應管Ct，2-ΔΔCt法計算血清miR-181a mRNA 相對表達量。另一份用于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清SIRT1、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 病情和預后評估

ARDS 組入NICU 后24 h 內，于首次機械通氣時計算氧合指數（OI），OI=平均氣道壓×動脈血氧分壓/吸入氧濃度×100。參考《“新生兒急性呼吸窘迫綜合征”蒙特勒標準（2017年版）》[6]進行病情嚴重程度評估，分為重度組49 例（OI ≥16）、中度組53 例（氧指數8≤OI < 16）、輕度組60 例（4 ≤OI<8）。根據患兒痊愈出院或病情危重放棄、轉院、死亡分為預后不良組68 例和預后良好組94 例。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 27.0 統計軟件，計數資料以構成比（%）表示，比較做χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）或中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，比較做t檢驗或Z檢驗或H檢驗；H檢驗的兩兩比較做Bonferroni 校正檢驗；相關性分析用Pearson 或Spearman 法；繪 制ROC 曲 線。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-181a mRNA 相對表達量、SIRT1和炎癥因子水平比較

兩組血清miR-181a mRNA 相對表達量、SIRT1、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），ARDS 組血清miR-181a mRNA相對表達量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于對照組，SIRT1 水平低于對照組。見表1。

表1 兩組血清miR-181a mRNA相對表達量、SIRT1和炎癥因子水平的比較

2.2 不同病情嚴重程度ARDS患兒血清miR-181a mRNA相對表達量、SIRT1和炎癥因子水平比較

輕度組、中度組、重度組患兒血清miR-181a mRNA 相對表達量、SIRT1、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，重度組和中度組患兒血清miR-181a mRNA相對表達量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于輕度組，且重度組血清miR-181a mRNA 相對表達量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于中度組（P<0.05）；重度組和中度組患兒血清SIRT1 水平低于輕度組，且重度組血清SIRT1 水平低于中度組（P<0.05），見表2。

表2 不同病情嚴重程度ARDS患兒血清miR-181a mRNA相對表達量、SIRT1和炎癥因子水平比較 M（P25，P75）

2.3 ARDS 患兒血清miR-181a mRNA 相對表達量、SIRT1與氧指數、炎癥因子的相關性

ARDS 組患兒OI 為4～22 [11.00（6.00，17.00）]。相關性分析顯示，ARDS 患兒血清miR-181a mRNA相對表達量與SIRT1 呈負相關（rs=-0.788，P=0.000），與OI、IL-1β、IL-6、TNF-α 呈正相關（rs=0.780、0.833、0.776 和0.804，均P=0.000）；SIRT1與OI、IL-1β、IL-6、TNF-α呈負相關（rs/r=-0.836、-0.716、-0.691 和-0.754，均P=0.000）。見表3。

表3 ARDS患兒血清miR-181a mRNA相對表達量、SIRT1與OI、炎癥因子的相關性

2.4 預后不良組與預后良好組血清miR-181a mRNA相對表達量、SIRT1水平比較

兩組血清miR-181a mRNA 相對表達量、SIRT1水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），預后不良組血清miR-181a mRNA 相對表達量高于預后良好組，SIRT1 水平低于預后良好組。見表4。

表4 預后不良組與預后良好組血清miR-181a mRNA相對表達量、SIRT1水平比較 M（P25，P75）

2.5 血清miR-181a、SIRT1 單獨及聯合對ARDS患兒預后不良的評估價值

ROC曲線結果顯示，miR-181a評估ARDS患兒預后不良的最佳截斷值為1.59，AUC 為0.777（95% CI：0.705，0.839），敏感性為80.88%（95% CI：0.717，0.857），特異性為70.21%（95% CI：0.652，0.757）；SIRT1 評估ARDS 患兒預后不良的最佳截斷值為0.70 ng/ml，AUC 為0.788（95% CI：0.717，0.848），敏感性為76.47%（95% CI：0.712，0.796），特異性為87.23%（95% CI：0.832，0.917）。兩者聯合評估ARDS患兒預后不良的AUC 為0.907（95% CI：0.851，0.947），敏感性為5.29%（95% CI：0.788，0.902），特異性為81.91%（95% CI：0.774，0.886）。見圖1。

圖1 血清miR-181a、SIRT1單獨及聯合評估ARDS患兒預后不良的ROC曲線

3 討論

ARDS 是一個彌散性肺損傷過程，影像學上病理性改變為雙側肺組織多個肺野的肺泡不規則滲出，新生兒ARDS 是新生兒期常見危重癥，具備壞死性小腸結腸炎、新生兒窒息、嗆奶、胎糞吸入綜合征等獨特的觸發因素，且新生兒還存在肺生物學、成熟度、支氣管肺發育不良易感性、免疫功能低下等差異，因此新生兒ARDS 往往臨床后果較兒童和成人ARDS 更嚴重[7]。目前兒童和成人ARDS 相關診斷標準已得到廣泛認可，而新生兒ARDS 相關診斷標準仍然未形成共識，缺乏統一的預防和救治措施，病死率較高，早期評估新生兒ARDS 病情嚴重程度和預后對實施治療和改善預后意義重大。炎癥反應失控是ARDS 發生發展的關鍵環節，肺內、肺外各種致病因素引起的急性失控性炎癥反應可直接侵襲肺組織引起肺水腫，導致肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞屏障的通透性增高，各種富含蛋白、炎癥細胞的水腫液進入肺泡腔和肺間質，引起ARDS，過度炎癥反應還可引起彌漫性肺泡毛細血管膜損傷，導致ARDS 進一步發展[8]。

miRNAs 是一類由19～24 個核苷酸組成的內源性單鏈非蛋白質編碼RNA，通過與靶基因mRNA 的3'-非翻譯區的堿基互補結合調節靶基因功能，近年研究證實，miRNAs 參與ARDS 炎癥反應進展[4]。miR-181 是一個進化及保守的分子，miR-181a 為miR-181 家族成員之一，是一種炎癥應激性miRNA，miR-181a 表達改變參與多種炎癥相關疾病發生發展。如ABDUL-MAKSOUD 等[9]研究顯示，miR-181a 在系統性紅斑狼瘡患者血清中表達上調，與疾病活動指數相關。如崔昭等[10]研究顯示，炎癥性腸病患者血清miR-181a 表達上調，與腸道菌群失調相關。上述研究提示miR-181a 在多種疾病中發揮促炎作用。本研究ARDS 組血清miR-181a mRNA 相對表達量升高，提示miR-181a 可能參與新生兒ARDS 發生；輕度組、中度組、重度組患兒血清miR-181a mRNA 相對表達量呈依次升高趨勢，且與評估新生兒ARDS 病情嚴重程度的OI 呈正相關，說明miR-181a 參與新生兒ARDS 發生發展。IL-1β、IL-6、TNF-α 是重要的促炎細胞因子，基礎研究證實其在ARDS 炎癥反應中發揮重要作用[11]，本研究結果顯示，ARDS 患兒血清miR-181a mRNA 相對表達量與IL-1β、IL-6、TNF-α 水平呈正相關，提示miR-181a 高表達可能通過炎癥反應途徑參與新生兒ARDS 進展。其機制可能與miR-181a能靶向Toll 樣受體4 激活NF-κB 信號通路有關[4]。近期李淵等[12]研究也證實，抑制急性肺損傷小鼠miR-181a 表達能降低小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和肺泡上皮細胞細胞凋亡率，逆轉肺組織水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡隔增厚、肺泡腔縮小等病理改變。

SIRT1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性酶，可通過對組蛋白和非組蛋白等轉錄因子進行脫乙酰作用，參與細胞衰老、基因轉錄、能量平衡、氧化應激、炎癥反應等多種生理功能的調控[13]。SIRT1 具有重要抗炎作用，如SHI 等[14]研究報道，在術后認知功能障礙患者中SIRT1 表達下調，上調SIRT1 表達能通過Toll 樣受體4/NF-κB 信號通路抑制IL-1β，IL-6，TNF-α 等炎癥細胞因子表達。在慢性阻塞性肺疾病小鼠研究中[15]，上調SIRT1 表達也能通過抑制NF-κB 信號通路抑制肺部IL-6、IL-8 等炎癥細胞因子表達。本研究結果顯示，ARDS 組血清SIRT1 水平降低，提示SIRT1 可能參與新生兒ARDS 發生。進一步分析顯示，輕度組、中度組、重度組患兒血清SIRT1 水平呈依次降低趨勢，與OI 呈負相關，說明SIRT1 參與新生兒ARDS 發生發展，分析與ARDS 患兒機體內部炎癥反應上調降低了SIRT1 活性有關。本研究結果還顯示，ARDS患兒血清SIRT1水平與IL-1β、IL-6、TNF-α 水平呈負相關，提示SIRT1 低表達可能通過炎癥反應途徑參與新生兒ARDS 進展。分析與SIRT1 能調節NF-κB 轉錄有關，NF-κB 為炎癥反應關鍵轉錄因子，需經歷乙酰化和磷酸化等多種翻譯后修飾才能發揮作用，而SIRT1 作為一種去乙酰化酶，其表達降低會增強NF-κB 乙酰化，促進NF-κB 轉錄，導致炎癥反應激活及加劇[16]。在ARDS 小鼠模型中也能檢測到肺組織、肺泡灌洗液SIRT1 mRNA 表達下調，通過重組SIRT1 或SIRT1 激活劑激活SIRT1 能顯著抑制炎癥細胞因子釋放，并改善肺組織病理變化[17]。miR-181a 是目前發現幾個能靶向降調節和/或維持SIRT1 低水平的miRNA 之一，RONG 等[18]研究報道，miR-181a 能靶向SIRT1抑制鵝顆粒細胞活力，誘導鵝顆粒細胞凋亡；WU等[19]研究報道，抑制miR-181a 可靶向SIRT1 抑制NF-κB 信號通路激活，減輕膿毒癥誘導的炎癥反應。本研究結果也顯示，ARDS 患兒血清miR-181a mRNA 相對表達量與SIRT1 水平呈負相關，提示miR-181a 和SIRT1 可能共同通過炎癥反應參與新生兒ARDS 發生發展。與李淵等[12]研究報道膿毒癥誘導的急性肺損傷小鼠模型中miR-181a 與SIRT1 存在靶向關系符合，但關于miR-181a 是否能靶向SIRT1參與新生兒ARDS 發生發展還需研究證實。本研究結果還顯示，預后不良組血清miR-181a 水平更高，SIRT1 水平更低，考慮也與miR-181a 參與ARDS 炎癥反應和SIRT1 具有抑制ARDS 炎癥反應有關，提示兩者可能成為新生兒ARDS 預后評估指標。本研究進一步通過繪制ROC 曲線也證實，miR-181a、SIRT1 均對新生兒ARDS 預后不良具有評估價值，且二者聯合AUC 達到了0.90，說明聯合檢測血清miR-181a、SIRT1 水平能更好評估新生兒ARDS 病情嚴重程度及預后，有利于指導臨床制訂治療方案。

綜上所述， 新生兒ARDS 血清miR-181a、SIRT1 水平與ARDS 患兒病情嚴重程度及預后密切相關，可作為新生兒ARDS 預后評估指標。但本研究為單中心小樣本研究，未動態監測血清miR-181a、SIRT1 水平變化，還需多中心大樣本研究證實。