芪蛭通脈顆粒對(duì)冠心病血脂異常大鼠PCSK9/LDLR通路的影響*

宋欠紅 樊 睿 李 易 葉 勇 柳 堯 何昕徽 趙 淳△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省昆明市中醫(yī)院，云南 昆明650500）

血脂異常主要包括血漿總膽固醇（TC）、三酰甘油（TAG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）代謝異常。TC、TAG、LDL-C升高和（或）HDL-C降低為常見(jiàn)類型。血脂異常是多種心腦血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管意外、高血壓、冠心病等的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。我國(guó)高脂血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為危害健康的重要因素［2］。

芪蛭通脈顆粒是云南省榮譽(yù)名中醫(yī)、云南中醫(yī)藥大學(xué)終身教授趙淳教授經(jīng)驗(yàn)方。運(yùn)用該方治療血脂異常取得較好的臨床療效，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方對(duì)血脂異常患者TC、TG、LDL-C、HDL-C調(diào)控作用明顯。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)觀察芪蛭通脈顆粒對(duì)冠心病大鼠血脂異常的調(diào)節(jié)作用及前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PC?SK9）/低密度脂蛋白受體（LDLR）信號(hào)通路相關(guān)蛋白及血管細(xì)胞間黏附分子1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的調(diào)控，探討其對(duì)血脂異常的作用機(jī)制［3-5］。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SPF級(jí)Wistar大鼠60只，體質(zhì)量220～260 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）2018-0003，大鼠合格證號(hào)：430067000017126。實(shí)驗(yàn)前1周在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，濕度：30%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 自擬方芪蛭通脈顆粒（由炙黃芪20 g，水蛭粉3 g，三七6 g，紅曲6 g，燈盞細(xì)辛15 g組成），由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：2008029）。阿托伐他汀鈣片，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)（規(guī)格：20 mg/片，批號(hào)：ED02825）。

1.3 試劑與儀器 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔源PCSK9抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling technology公司；兔源LDLR抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling technology公司；兔抗鼠VCAM-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abeam公司；兔抗鼠ICAM-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)santa-cmze公司。TAG、TC、HDL-C、LDL-C檢測(cè)試劑盒購(gòu)自星漢科技公司。電子分析天平由德國(guó)sartorius公司生產(chǎn)；凝膠成像設(shè)備由美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)。

1.4 造模與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為：空白對(duì)照組、模型組、阿托伐他汀組以及芪蛭通脈顆粒高、中、低劑量組。在張文立等［6-7］報(bào)道方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，復(fù)制大鼠冠心病模型。除空白對(duì)照組外，其余各組均喂飼高脂飼料（10%豬油，2%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，87.3%基礎(chǔ)飼料）8周，每日灌胃1次，按5 mL/kg液體量灌胃，空白對(duì)照組給予等量蒸餾水灌胃。第8周第4日開(kāi)始，空白對(duì)照組繼續(xù)給予等量蒸餾水灌胃。其余組給予垂體后葉素腹腔注射，按每次30 U/kg，每日1次，連續(xù)給藥3 d。第3日注射后30 min內(nèi)描記心電圖，若滿足ST段抬高超過(guò)0.1 mV，T波高聳，心律不齊，則視為造模成功。

1.5 干預(yù)方法 實(shí)驗(yàn)組于第9周開(kāi)始灌藥，連續(xù)治療4周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與成人用藥量的換算方法參考文獻(xiàn)［8］，阿托伐他汀鈣組給予阿托伐他汀鈣水溶液灌胃（按10 mg/mL水溶液，13 mg/kg體質(zhì)量給藥）；芪蛭通脈低、中、高劑量組予以芪蛭通脈藥液1、2、4倍給藥（按1 g/mL水溶液，6.5 g/kg為低劑量，13 g/kg為中劑量，26 g/kg為高劑量給藥）。空白對(duì)照組與模型組灌胃等劑量生理鹽水。

1.6 觀察指標(biāo) 12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將動(dòng)物分別稱重，按體質(zhì)量予以5 mL/kg腹腔內(nèi)注入10%水合氯醛麻醉。待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定四肢，碘伏消毒皮膚，切開(kāi)胸腹壁組織，暴露主動(dòng)脈，在腹主動(dòng)脈處5號(hào)采血針采血5 mL，室溫2 000 r/min離心20 min后，取上清液即血清分裝于ependor管置于-20℃冰箱。1）檢測(cè)血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。2）Western blotting法檢測(cè)PCSK9、LDLR、VCAM-1和ICAM-1等蛋白水平。打開(kāi)腹腔，清除淤血，取出肝臟組織，用眼科剪剪碎，放置于10 mL離心管中，加入裂解液，勻漿器勻漿，使其充分裂解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心15 min，溫度4℃，取上清液，-80℃環(huán)境中保存；按BCA說(shuō)明書(shū)蛋白定量測(cè)定，根據(jù)蛋白分子量配置合適濃度的分離膠與濃縮膠，連接好電泳設(shè)備，將電壓調(diào)制80 V電泳，預(yù)染Marker分離出紅色條帶后，將電壓調(diào)到120 V恒定。加入轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后孵育一抗，洗膜，孵育二抗，顯色，得出待測(cè)蛋白的條帶，用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶后進(jìn)行光密度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，運(yùn)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組和芪蛭通脈低、中、高劑量組大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平均降低（P<0.05）；阿托伐他汀組和芪蛭通脈低、中、高劑量組大鼠血清HDL-C水平均較模型組升高（P<0.05）；芪蛭通脈低、中、高劑量組大鼠血清HDL-C水平與阿托伐他汀組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平與阿托伐他汀組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較（mmol/L，±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與阿托伐他汀組比較，△P<0.05。下同。

組別空白對(duì)照組模型組阿托伐他汀組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 10 10 10 10 10 TAG 0.81±0.04**2.76±0.32 1.05±0.22 1.93±0.27*△1.31±0.30*1.23±0.29*TC 3.55±0.68**9.31±1.23 5.17±0.88 6.58±1.01*△6.33±1.05*5.89±0.97*HDL-C 1.92±0.23**0.65±0.05 1.28±0.15 1.22±0.21*1.31±0.24*1.35±0.16*LDL-C 1.87±0.21**5.81±0.73 3.03±0.36 3.63±0.44*△3.55±0.55*3.82±0.56*

2.2 各組大鼠肝臟PCSK9、LDLR表達(dá)水平 見(jiàn)圖1，表2。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟PCSK9水平上調(diào)（P<0.01），LDLR表達(dá)水平下調(diào)（P<0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組、芪蛭通脈中、高劑量組PCSK9水平下調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，阿托伐他汀組、芪蛭通脈低、高劑量組LDLR水平上調(diào)（P<0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組與阿托伐他汀組比較，在PCSK9方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；芪蛭通脈低劑量組與阿托伐他汀組比較，在PCSK9方面有明顯差異（P<0.05），芪蛭通脈低、高劑量組與阿托伐他汀組比較，在LDLR方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；芪蛭通脈中劑量組與阿托伐他汀組比較，在LDLR方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

圖1 各組大鼠肝臟PCSK9、LDLR表達(dá)水平

表2 各組大鼠肝臟PCSK9、LDLR相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠肝臟PCSK9、LDLR相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

組別空白對(duì)照組模型組阿托伐他汀組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 10 10 10 10 10 PCSK9 0.60±0.15**1.53±0.22 0.89±0.16*1.24±0.31△0.91±0.17*0.79±0.21*LDLR 0.69±0.15**0.41±0.05 0.68±0.09*0.58±0.10*0.52±0.09△0.62±0.12*

2.3 各組大鼠肝臟VCAM-1和ICAM-1表達(dá)水平 見(jiàn)圖2，表3。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟VCAM-1、ICAM-1水平上調(diào)（P<0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組、芪蛭通脈中、高劑量組VCAM-1和ICAM-1水平下調(diào)（P<0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組與阿托伐他汀組比較，在VCAM-1、ICAM-1方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；芪蛭通脈低劑量組與阿托伐他汀組比較，在VCAM-1、ICAM-1方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 各組大鼠肝臟VCAM-1和ICAM-1表達(dá)水平

表3 各組大鼠肝臟VCAM-1和ICAM-1相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠肝臟VCAM-1和ICAM-1相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

images/BZ_47_1248_1602_2252_1664.png空白對(duì)照組模型組阿托伐他汀組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組10 10 10 10 10 10 0.43±0.08**0.91±0.26 0.66±0.11 0.91±0.18△0.78±0.14*0.74±0.21*1.02±0.17**1.66±0.36 1.13±0.22 1.31±0.26△1.19±0.24*1.11±0.16*

3 討論

高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的首要危險(xiǎn)因素，臨床常用的治療藥物有他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑、煙酸等。但長(zhǎng)期用藥特別是他汀類會(huì)引起谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶升高，出現(xiàn)肌痛、肌炎、橫紋肌溶解、頭痛、失眠、抑郁及消化不良等不良反應(yīng)［9］。

本文通信作者趙淳教授認(rèn)為高脂血癥的發(fā)生發(fā)展是由于飲食不節(jié)、過(guò)食肥甘和（或）由于正虛，脾肝腎三臟功能失調(diào)（體內(nèi)脂“糖”代謝紊亂，這里糖為廣義的糖，包括單糖、雙糖、多糖），致氣血不歸正化，而產(chǎn)生痰瘀，并互結(jié)為患，又加重脾肝腎功能失調(diào)，互為因果，形成惡性循環(huán)。其主要治法是益氣活血、健脾化痰、化瘀通絡(luò)。冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”病范疇，歷代醫(yī)家重視“陽(yáng)微陰弦”理論。趙淳教授結(jié)合現(xiàn)代氣候、環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、工作生活方式、體質(zhì)等的變化，認(rèn)為諸邪化熱、熱毒致瘀、瘀阻心絡(luò)是冠心病的主要病機(jī)之一。患者體內(nèi)的肥甘、膏脂形成痰毒、瘀毒等蓄積蘊(yùn)結(jié)，變生熱毒，敗壞形體、損傷心與心絡(luò)，導(dǎo)致胸痹心痛的各種病理演變。芪蛭通脈顆粒即是在該理論的指導(dǎo)下，結(jié)合民族醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的治療高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管病患者安全有效的驗(yàn)方。芪蛭通脈顆粒由炙黃芪、水蛭粉、三七、紅曲、燈盞細(xì)辛組成。方中君藥黃芪益氣補(bǔ)中，補(bǔ)益胸中大氣，臣藥水蛭破血通經(jīng)，逐瘀消瘕，含有抗血栓作用活性物，三七活血化瘀、消腫定痛。佐藥紅曲健脾消食，活血化痰。使藥燈盞細(xì)辛有活血通絡(luò)止痛，祛風(fēng)散寒之功效。全方具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，本方中黃芪可增強(qiáng)體液免疫功能，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，改善心功能，具有調(diào)節(jié)血糖，抗衰老作用；水蛭有抗凝血，直接抑制凝血酶，促纖溶，改善血流變學(xué)，抗血栓形成，溶栓，抗血小板聚集，降低血液黏度，調(diào)節(jié)血脂，穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，增加心肌營(yíng)養(yǎng)血流量，改善局部血液循環(huán)等綜合抗凝、抗栓作用；三七有散瘀止血、消腫定痛、抗血栓、促進(jìn)造血、擴(kuò)血管、降血壓、抗心肌缺血、抗腦缺血、抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用；紅曲是細(xì)胞自身產(chǎn)生的天然氧化劑，能抑制線粒體的過(guò)氧化，有保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)完整性的功能，可降低內(nèi)源性膽固醇，加速膽固醇代謝，調(diào)節(jié)載脂蛋白質(zhì)，保護(hù)改善血管內(nèi)皮功能，改善心肌重構(gòu)，改善心肌舒縮功能，有利尿、提高免疫功能、抗腫瘤、增強(qiáng)心肌收縮力等作用；燈盞細(xì)辛有改善血液流變學(xué)作用，防治心肌梗死后再灌注損傷，改善腦缺血，微血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)。

LDL-R是LDL主要的受體，是肝臟組織表達(dá)最為豐富的膜糖蛋白，介導(dǎo)了肝臟細(xì)胞對(duì)脂蛋白的代謝和攝取，在脂蛋白代謝中具有十分重要的意義，是脂蛋白代謝的重要干預(yù)靶點(diǎn)，是調(diào)節(jié)機(jī)體血脂水平的重要因素［10-11］。肝臟是發(fā)生受體介導(dǎo)的LDL-C清除的主要場(chǎng)所［12］。PCSK9能夠使血清中使血漿中LDL-C水平升高是基于其與LDLR結(jié)合，形成復(fù)合物，導(dǎo)致LDLR降解。PCSK9抑制劑可阻止LDLR降解，促進(jìn)LDL-C的清除，目前市場(chǎng)上PCSK9抑制劑主要為PCSK9單克隆抗體。VCAM-1和ICAM-1是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的一種重要糖蛋白，容易引起單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附，進(jìn)入內(nèi)皮，分化成為巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊形成［13-14］。VCAM-1、ICAM-1過(guò)度表達(dá)與冠心病密切相關(guān)，VCAM-1促進(jìn)炎癥細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生黏附，ICAM-1促使炎癥細(xì)胞黏附于血管表面［15-16］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芪蛭通脈顆粒低、中、高劑量組能夠下調(diào)冠心病血脂異常，大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平，升高血清HDL-C水平，表明芪蛭通脈顆粒有一定的調(diào)脂作用。芪蛭通脈顆粒可下調(diào)PCSK9、VCAM-1和ICAM-1表達(dá)，上調(diào)LDLR表達(dá)，表明其調(diào)脂作用可能是通過(guò)調(diào)控PCSK9/LDLR、VCAM-1/ICAM-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，這為冠心病血脂異常的藥物開(kāi)發(fā)提供了一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。