外泌體miRNA在心血管疾病中的研究進展

孫碩 康品方，2 張恒

(1.蚌埠醫學院第一附屬醫院心血管內科，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠醫學院心腦血管病研究中心，安徽 蚌埠 233000)

外泌體(exosome)是多數細胞分泌的直徑40～150 nm的微小囊泡，具有相對穩定的脂質雙層膜結構。近期發現，外泌體中含有可作為信號因子的特異性蛋白、脂質和核酸等，影響其他細胞的活性和功能，參與人體的生理與病理過程[1]，在心血管疾病的預防、診斷和治療等多方面發揮重要作用。其主要作用是物質傳遞與信號轉導，這依賴于其內含豐富的遺傳學信息，包括微小RNA(miRNA)、競爭性內源RNA、信使RNA(mRNA)和DNA等。miRNA被雙層膜狀結構包裹，穩定性更高。前期研究發現外泌體中的miRNA較分泌外泌體的體液或細胞的miRNA表達水平更高[2]，因此，對外泌體中miRNA的測序研究具有更高的臨床價值。外泌體miRNA參與到多種疾病的發生和發展過程中，包括血管生成、免疫應答、腫瘤增殖侵襲和抗原表達等[3]?，F就外泌體miRNA在心血管疾病病理過程中的最新研究做一概述。

1 外泌體的發現與生成

胞外囊泡的產生是由胞外物質進入胞內攝入一些蛋白質、核酸片段和肽類等活性因子后再被分泌至胞外的一系列過程，由于目前很難純化和細分外泌體亞群，通常得到的是直徑<200 nm的囊泡，因此越來越多的人開始稱之為小細胞外囊泡。外泌體最早是在研究網織紅細胞向成熟紅細胞轉變時發現的[4]，1987年被命名為“exosome”。血小板、T/B細胞、肥大細胞和樹突細胞等均可分泌外泌體進入體液中，參與胞間通訊，共同維持機體內環境的穩態。

自2007年[5]首次在外泌體中發現mRNA和miRNA后，外泌體miRNA和各種疾病的相關性研究便逐年增多。miRNA是根據堿基互補原則直接調控mRNA的穩定性來調控細胞行為的小RNA分子。外源性RNA傳遞是一種有效的細胞信號傳遞方法，這一過程也必然會影響受體細胞的生物學功能，因此，某些miRNA可能作為生物標志物，對疾病的診斷、治療和轉歸提供信息[6]。隨著高通量測序方法的逐漸成熟，大量的基因片段測序成為可能，也使得外泌體和基因組學的結合成為近年的研究熱點。外泌體自身的組分會隨著胞內物質的釋放和內環境的變化而發生特異性的改變，這些特征為其作為疾病的診斷工具提供了可能性。此外，近年研究發現各種干細胞、血小板和內皮細胞(endothelial cells，ECs)等衍生的外泌體在促進血管再生和修復受損心臟等方面發揮著重要的作用[7]。

2 外泌體和心血管疾病

2.1 外泌體miRNA和動脈粥樣硬化

血管鈣化在高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟病和糖尿病等疾病中常見，血管壁僵硬和順應性下降可顯著增加心肌缺血、斑塊破裂和心力衰竭等風險。目前有研究證實胞外囊泡是病理性血管鈣化的新參與者，調節平滑肌的分化和鈣磷代謝，促進血管鈣化[8]。成骨相關基因的表達上調加速血管平滑肌細胞向成骨樣細胞的表型轉變，是血管鈣化的重要病理過程[9]。研究發現，高級糖基化終產物牛血清白蛋白通過抑制miR-146a，增加了硫氧還蛋白互作蛋白的表達，從而促進活性氧的產生和血管平滑肌的鈣化，糖基化終產物牛血清白蛋白預處理或miR-146a轉染骨髓間充質干細胞產生的外泌體可通過下調硫氧還蛋白互作蛋白基因來部分抑制血管平滑肌的鈣化[10]。ECs外泌體攜帶的miR-195過度表達5-羥色胺轉運蛋白調控大鼠頸動脈平滑肌細胞的增殖，氟西汀(5-羥色胺轉運蛋白抑制劑)干預可抑制大鼠頸動脈內膜新生物的形成[11]。在正常狀態下，外泌體發揮生理功能，維持穩態，但在病理環境中，由于細胞骨架方向的改變或囊泡運輸和貨物裝載過程中的損傷，某些小囊泡產生了促進分化的潛能[12]。

ECs的外泌體可能是動脈粥樣硬化斑塊中破壞微鈣化穩態的重要介質。粥樣硬化起源于ECs損傷，先后合并脂質沉積、纖維增生和鈣質沉著等，最終導致動脈管壁增厚變硬，管腔縮小[13]。ECs衍生微粒miR-19b可通過調控細胞因子信號抑制因子3，激活血管周圍脂肪組織低水平促炎狀態，促進ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化[14]。有些外泌體的miRNA通過介導ECs與平滑肌細胞之間的信息交換，活躍在動脈粥樣硬化的各個階段。Zernecke等[15]發現ECs衍生的小囊泡通過富集miR-126向附近細胞傳遞警報信號，靶向抑制負調節因子G蛋白信號調節子16，使趨化因子12“解鎖”，從而驅動趨化因子受體4的表達。同時，miR-126可調節ECs對血管內皮生長因子的反應來調控血管的完整性和側支血管生成，具有動脈粥樣硬化保護作用。

暴露在層流中的ECs經歷高度的剪切應力形成湍流，通?？拷鼜澋篮头植嫣?，會產生較低的內皮剪切應力，促進動脈粥樣硬化的形成。Krüppel樣轉錄因子2在這一過程起重要作用。Krüppel樣轉錄因子2誘導外泌體富集miRNA(主要為miR-143/145)，轉移到平滑肌細胞中，降低靶基因表達，抑制動脈粥樣硬化進程[16]。Pan等[17]發現與小鼠ECs相比，細胞鈣化模型的外泌體中顯著上調和下調miRNA分別有987和92個。差異miRNA的靶基因參與了多種生物學過程，如發育、代謝、細胞成分和生物發生，以及蛋白激酶B等多種信號通路。綜上所述，外泌體在ECs鈣化過程中主要發揮信使作用。

2.2 外泌體miRNA和心肌損傷及壞死

當冠狀動脈狹窄到一定程度，心肌供需平衡被打破，血流量不能滿足心肌代謝的需要，引起心肌缺血即心絞痛和心律失常等癥狀，持續的嚴重心肌缺血可引起心肌梗死。斑塊中細胞釋放的炎癥物質會破壞纖維帽的完整性，管腔內壓力或心肌搏動產生的剪切應力等均可能造成血栓脫落或斑塊破裂，阻塞下游血管，引起急性心絞痛或心肌梗死。心肌損傷可誘導心肌細胞凋亡，外泌體通過運輸包括miRNA和蛋白質等細胞質成分，促進細胞間通信[18]。

既往研究表明血液循環中外泌體miRNA譜的改變有助于心肌損傷及修復的發生和發展，是心臟微環境的重要組成部分。缺氧會刺激心臟ECs分泌富含miR-126和miR-210的外泌體，通過激動PI3K/Akt途徑增強心臟祖細胞對低氧應激的抵抗力[19]。低氧狀態下的心臟祖細胞外泌體含有較豐富的miRNA，如miR-17、miR-292和miR-199a等，能誘導ECs的毛細血管樣結構形成，降低結締組織生長因子、波形絲蛋白、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原水平，增強修復作用[20]。某些miRNA，如miR-29b、miR-323-5p、miR-455和miR-466等，在心肌細胞的外泌體中高度富集，調節了糖尿病心臟組織中基質金屬蛋白酶9的表達[21]，促進ECs的增殖及毛細血管樣結構的形成，保護氧化損傷的心肌細胞。miR-144則在缺血再灌注損傷心肌細胞中下調，心肌細胞內miR-144含量可被遠距離缺血調節所調控[22]。miR-144通過激活PI3K/Akt和p44/p42 MAPK信號，緩解雷帕霉素對心肌細胞的損傷，刺激細胞自噬來增強心臟保護作用[23]。

也有研究發現急性心肌梗死時，心肌細胞分泌外泌體可介導局部炎癥反應。Zhang等[24]發現心肌梗死組來源H9c2細胞，與心肌缺血再灌注損傷模型組和假手術組相比，miR-203水平顯著降低，而過表達miR-203可通過增加B細胞淋巴瘤/白血病-2，降低B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白，裂解胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9來減弱梗死誘導的細胞凋亡，明顯改善心肌梗死后大鼠心功能，縮小梗死面積。miR-203還可通過調節蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B來阻止心肌細胞梗死后的凋亡過程，具有減輕急性缺血對心肌組織的損傷，減少線粒體介導的凋亡的作用，可能是急性心肌梗死治療的潛在靶點。肌鈣蛋白是目前臨床常用的檢測心肌細胞損傷的指標，但并不是特異性指標，也可在慢性腎功能衰竭、肺栓塞和非心臟手術等多種病理狀態下高表達。在急性心肌梗死中，有些miRNA在血液中迅速出現，其中miR-1、miR-133a/b、miR-208a和miR-499表達尤為特異[25]。這表明心肌細胞來源的外泌體可能較肌鈣蛋白更早在血液中被檢測，有希望作為急性心肌梗死早期診斷的標志物。

2.3 外泌體miRNA和心肌重構

在心肌肥厚的代償過程中，心肌細胞、膠原纖維網和胞外基質等均發生相應的變化，即心室重塑，是心力衰竭發生和發展的基本病理機制。外泌體可通過調節細胞增殖，改變局部微環境，促進局部微血管網絡的形成和再生來修復受損的心肌組織。Yang等[26]發現低氧可誘導miR-30a上調，并向外泌體富集，抑制miR-30a可增加心肌細胞自噬相關因子beclin-1、Atg 12和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達，從而增強缺氧后心肌細胞的自噬反應。低氧心肌細胞外泌體通過旁分泌方式轉運miR-30a來調節心肌細胞的自噬。Yang等[27]發現，在大鼠心肌纖維化模型中，心肌細胞衍生外泌體miR-208a顯著上調。

由心肌細胞衍生的外泌體miRNA可通過靶向下游mRNA來調節心臟功能[28]，介導心肌修復和修復后的細胞間通訊，如let-7i-5p、miR-21-5p、miR-27A、miR-28-3p、miR-34a、miR-143、miR-222和miR-378-3p等。Qiao等[29]給急性心肌梗死模型小鼠心肌內注射正常供體心臟來源外泌體，可改善心臟結構和功能，而注射心力衰竭供體來源外泌體則加重了心功能的惡化和左心室重塑，進一步研究發現miR-21-5p通過PTEN/Akt途徑促進血管生成和心肌細胞存活。miR-21*在心肌結構和功能的組織中起重要作用，抑制血管緊張素Ⅱ所致心肌肥厚。小鼠miR-21*水平可延緩心肌細胞的肥大生長[30]。為了加速心肌細胞損傷恢復，心臟成纖維細胞可分泌含有miR-21、miR-208a和miR-499等的外泌體，使心肌代償性肥厚，穩定心臟泵血功能[31]。但因缺乏適當的控制，這些外泌體的過度產生也可能會促進心肌肥大的發展。通過對心房顫動和竇性心律患者血漿外泌體進行高通量測序，Wang等[32]發現4種差異血漿外泌體miRNA，即miR-483-5p、miR-142-5p、miR-223-3p和miR-483-5p，與心房顫動獨立相關，這些miRNA及其靶基因影響心房功能和結構，參與氧化應激和纖維化途徑，對心肌細胞重塑具有重要作用。

由心臟祖細胞衍生的外泌體可刺激ECs遷移，這可能有助于心臟修復和梗死心臟組織的新生血管化，也有研究表明外泌體也能通過促進ECs遷移、增殖和單核細胞活化達到內皮修復的目的[6]。對缺血性心臟病和慢性心力衰竭患者，這些發現有望發展新的治療策略。

3 結語

心血管疾病占全世界人口死因1/3左右。鑒于死亡率高，需采取新的預防和干預心血管疾病的策略。外泌體含有多種信號分子，通過結合、融合或內吞參與細胞間物質的傳遞和信息交換[5]。外泌體介導靶細胞的基因表達，調節細胞的病理和生理過程，在各種疾病的發生和發展中發揮關鍵作用。因此，外泌體miRNA在心血管疾病診療方面有廣闊的前景。