水稻土細菌群落對長期施肥和短期氮添加的響應*

曹彥強，張中峰，徐廣平，滕秋梅，蔣先軍

(1.西南大學資源環境學院，重慶 400715；2.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西喀斯特植物保育與恢復生態學重點實驗室，廣西桂林 541006)

0 引言

細菌作為微生物的重要組成部分，其在有機質分解、腐殖質形成等諸多土壤生態過程中發揮著重要作用。目前，細菌的生態特性已逐漸成為評價土壤質量的重要指標，可用于指示土壤的肥力形成及其演變過程[1]。水稻土是我國重要的耕作土壤之一，也是耕地土壤中最為高產穩產的類型，約占全國耕地面積的1/5。但是，水稻土的形成狀態深受人為活動的影響[2]。例如，盡管化肥施入土壤帶來了作物的增產，但是會造成土壤板結、酸化和生物性狀下降等生態環境問題[3，4]。土壤細菌對環境條件具有較高敏感性，其結構和功能的改變能夠有效指示化肥施用下土壤環境或植被的變化。因此，近年來通過長期定位試驗來探究施肥對土壤細菌影響的研究受到人們的廣泛關注。陸海飛等[5]研究表明，與不施肥對照相比，有機/無機肥配施下土壤細菌的香農指數和豐富度指數顯著增大；邢亞薇等[6]通過實時熒光定量PCR (Real-time PCR)技術發現黃土旱塬農田單施化肥處理的細菌數量較不施肥裸地增加21%，pH、全氮和有機碳含量是影響土壤微生物群落豐度的重要因子；劉佳等[7]以祁陽紅壤實驗站的冬小麥-夏玉米定位試驗為研究對象，結果表明長期不同施肥方式改變了旱地紅壤優勢菌的相對豐度，長期施肥后旱地紅壤細菌群落主要受土壤pH的影響。

由于獨特的水分管理措施，水稻土細菌群落組成與其他耕作土壤的相比表現出諸多差異，但目前關于長期施肥下水稻土細菌群落變化的研究相對較少[8]。本研究依托1989年西南大學建立的中性紫色水稻土長期定位試驗站，針對不施肥(CK)和施用化肥(CF)兩種不同處理下的水稻土，通過MiSeq高通量測序，研究30年長期施肥對水稻土壤細菌的影響規律。由于氮素是植物生長和發育所必需的養分元素，氮肥是最主要的化肥施用類型[9]，因此本研究特意設置為期56 d的室內氮添加試驗，探究短期高強度氮添加對水稻土細菌群落的影響，以便深入了解長期施肥對水稻土細菌多樣性、群落結構和組成的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品采集地點位于國家紫色土長期定位試驗基地(106°26′E，30°26′N)，長期定位試驗始于1989年。于2019采集不施肥、施用化肥兩種水稻土樣品(分別用CK、CF表示)，其中年施肥量為尿素273.1 kg·hm-2，過磷酸鈣500.3 kg·hm-2，氯化鉀150.1 kg·hm-2。土壤樣品裝入無菌袋中運回實驗室，篩出碎石等雜物后在4℃冰箱暫存，用于后續分析測定以及室內氮添加試驗。

1.2 短期氮添加試驗

采用室內培養的方法，根據土壤含水量稱取過2 mm篩的鮮土(以10.00 g干重計)置于150 mL的玻璃廣口瓶。對不施肥水稻土和施肥水稻土每周分別添加氮濃度為50 mg·kg-1的CO(NH2)2。通過均勻添加無菌水調節土壤水分含量至田間持水量(WHC)的60%，并在培養過程中每隔7 d以稱重法補充蒸發損失的水分以保持土樣的水分含量恒定。將廣口瓶置于28℃恒溫培養箱中培養56 d。培養結束后取樣，并與原始土壤樣品一起進行高通量測序。使用CK+N和CF+N分別表示兩種水稻土加氮培養56 d后的土壤樣品。

1.3 土壤基本性質分析

1.4 土壤DNA的提取、高通量測序

本試驗所采用的DNA提取試劑盒為Fast DNA?SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)，并使用微量紫外分光光度計(NanoDrop ND-1000 UV-Vis)測定DNA濃度。使用引物F515 (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和R907(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)對細菌16S rRNA基因的V4-V5區域基因進行擴增；PCR反應程序為98℃預變性1 min，98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環。應用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序，并委托上海美吉生物科技有限公司完成。測序原始序列上傳至NCBI的SRA (Sequence Read Archive)數據庫，登錄號為SRP259259。

1.5 數據處理與統計分析

利用Excel 2010、SPSS 13、R software (Version 3.1.1)對數據進行處理與統計分析，使用Origin 8.5軟件作圖，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan法進行差異顯著性檢驗(ɑ=0.05)，用Spearman法進行相關分析。利用Mothur軟件(version 1.31.2)分析α多樣性指數(Chao1和Shannon指數)。基于Bray-Curtis距離矩陣的主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)計算不同處理下土壤細菌組成的差異性(β多樣性)。使用冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)闡明影響土壤細菌群落的關鍵環境因子。

2 結果與分析

2.1 不同處理下土壤化學性質

表1 不同土壤理化性質Table 1 Physicochemical properties of different soil

2.2 土壤細菌多樣性

水稻土樣品高通量測序共獲得313 581條優質序列，以97%相似性閾值進行Operational Taxonomic Unit (OUT)聚類，在CK、CF、CK+N和CF+N處理中分別得到1 349，1 624，1 301，1 524個OUT (表2)。Chao1指數通常用來描述群落豐富度，CF處理下的Chao1指數顯著高于CK處理(P<0.05)。短期氮添加后Chao1指數與未加氮土樣相比并未產生顯著差異。對于Shannon指數，呈現出與Chao1指數類似的變化，CF處理相較于CK處理顯著提高了水稻土壤細菌群落多樣性(P<0.05)。

表2 細菌群落α多樣性指數表(97%序列相似性)Table 2 Alpha diversity index table of bacterial community (97% sequence similarity)

不同處理間水稻土細菌群落組成差異的PCoA分析結果如圖1所示。在OTU水平上，PCoA1與PCoA2分別解釋變量方差為43.16%和11.42%，累計解釋度達54.58%，PCoA1可將CK和CK+N的細菌群落與CF、CF+N明顯區分開。56 d氮添加后的土壤樣品與原始土樣相比分離距離較小，未明顯分開，短期施氮對微生物群落結構產生的影響較小。

圖1 不同處理土壤細菌群落主坐標分析(PCoA)Fig.1 Principal co-ordinate analysis (PCoA) of soil bacterial community under different treatments

2.3 土壤細菌群落物種組成

如圖2所示，在門水平上統計各樣本物種豐度，水稻土中的優勢菌門(>1%)包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。在CK處理中，上述優勢菌門的平均相對豐度分別為27.26%、19.04%、17.01%、14.42%、6.06%、5.69%、3.09%、1.93%和1.25%。在CF處理中，Proteobacteria、Planctomycetes和Bacteroidetes的平均相對豐度顯著高于CK處理(P<0.05)；而Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes和Firmicutes呈現出相反的情況。在所有樣品中，Proteobacteria、Acti-nobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi的總占比均超過70%，其中Proteobacteria的相對豐度均為最高。比較CK和CK+N可知，56 d的室內氮添加明顯提高了不施肥水稻土中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度(P<0.05)；對比CF和CF+N，短期氮添加顯著提升了施肥水稻土中Nitrospirae的相對豐度(P<0.05)。

不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05)圖2 土壤細菌優勢種群相對豐度Fig.2 Relative abundances of the dominant bacterial species in soil

2.4 土壤細菌群落與環境因子的相關性

表3 土壤環境因子與細菌多樣性指數、優勢菌門相對豐度之間的相關性系數Table 3 Correlation coefficient between soil environmental factors and bacterial diversity indices and relative abundance of dominant phyla

圖3 土壤細菌群落組成與環境變量的RDA分析Fig.3 Redundancy analysis (RDA) of soil bacterial community composition and environmental variables

3 討論

在本研究中，水稻土細菌群落的α多樣性(Chao1指數和Shannon指數)在施肥處理下有所提高，而有研究報道稱長期施肥導致土壤微生物多樣性降低[18，19]，這種差異可能源于施肥時間跨度的不同。另外，土壤細菌多樣性對肥料施用的響應并不一致，它們會隨著施肥方式、輪作、土壤類型、土地利用方式和其他因素的變化而有所不同[20，21]。一項調查45年稻田試驗中細菌群落演變的研究表明，長期施肥并未對水稻土微生物結構產生顯著影響[22]。細菌多樣性由pH主導，化肥施用導致的土壤酸化使得細菌多樣性降低[23]。相較于其他研究，本研究中pH值的波動較小，且營養物質水平明顯提高；Chao1指數和Shannon指數在氮添加前后并未產生顯著變化(表2)，表明短期氮添加對于土壤細菌α多樣性影響較小。

pH是決定土壤微生物群落結構的關鍵生態因子[7]，而土壤養分作為微生物生存發展的必要營養元素，在土壤中的有效性也成為影響或制約土壤微生物群落結構的重要因子[26]。本研究中，pH、AP、AK等環境因子對細菌群落結構與組成產生重要影響，這與大多數研究結果吻合[23,27]。

4 結論

綜上所述，長期施肥處理能夠影響水稻土壤pH、養分、土壤細菌多樣性、群落組成和結構；短期氮添加對土壤細菌多樣性特征影響較小。Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi在此次試驗水稻土中的占比超過70%。土壤pH和營養狀況(例如AP、AK、TP和TN等)是影響重慶地區水稻土細菌群落形成的主要驅動因子。在未來工作中，探究不同施肥處理間土壤微生物群落結構的差異及其原因，可為保持土壤微生物多樣性及農業可持續發展等提供重要的理論和實踐依據。