一測多評法測定壯藥三加皮中5個酚酸類成分的含量*

郭勇秀，蔣 林,2**，農(nóng)毅清，李芳嬋，隨家寧，魏博偉

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥工程技術(shù)中心，廣西南寧 530001；3.廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，廣西南寧 530001)

0 引言

三加皮是五加科植物白簕(Acanthopanaxtrifo-liatus(L.) Merr.)的干燥根，又名蹦樂、刺三甲、刺三加、白簕、鵝掌簕、苦刺、三葉五加等。在《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》《廣西植物名錄》《廣西中藥資源名錄》中均有記載，被收錄在《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第一卷)》，是廣西特色的民間常用藥用植物，其根皮可入藥，其嫩葉常作為蔬菜食用。三加皮味苦，辛，凉，主要含有酚酸類、黃酮類、多糖、皂苷等成分。藥理作用主要有祛風(fēng)利濕、舒筋活血、清熱解毒[1]，抗炎鎮(zhèn)痛、抗疲勞、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等[2-6]。

三加皮的食用部分一直備受關(guān)注，近年來學(xué)者們對其食用部位研究出多種保健品，有檸檬簕菜茶、陳皮簕菜茶、燕麥簕菜茶、皇竹草和簕菜減茶、簕菜泡騰固體飲料、簕菜保健餅干、簕菜保健顆粒、簕菜保健硬糖等[7-14]，但對藥用根部研究甚少，有學(xué)者對其根部總黃酮進(jìn)行研究[15]，對根部酚酸類成分研究報道較少，未見建立根部相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，難以對三加皮的質(zhì)量進(jìn)行控制，給臨床用藥及資源利用帶來較大的困難。可見對三加皮根部進(jìn)行研究，為后續(xù)建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究基礎(chǔ)及臨床用藥參考是很有必要的，也為開發(fā)利用三加皮藥用資源提供參考依據(jù)。

前期課題組對其質(zhì)量標(biāo)志物的分析發(fā)現(xiàn)，三加皮中所含的豐富的酚酸類成分是其主要活性成分之一，初步推斷三加皮中含有新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等成分，此類成分都屬于咖啡酰奎寧酸的酚酸類成分。據(jù)研究，該類成分有多種藥理活性，如有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[16]。在研究中，單一成分難以全面反映三加皮的質(zhì)量，因此需選擇多成分進(jìn)行質(zhì)量控制分析。但采用多成分對質(zhì)量控制時，部分對照品稀缺及使用量大、價格昂貴，導(dǎo)致測定成本增加，而一測多評法可以一種價廉、穩(wěn)定易得的指標(biāo)成分為內(nèi)參物，通過相對校正因子測定其他成分含量，同時測定多種成分并降低實(shí)驗(yàn)成本。目前尚未有相關(guān)研究建立新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的一測多評方法。因此，本研究擬建立測定多種活性成分含量的一測多評法，比較一測多評法(QAMS)與外標(biāo)法(ESM)測定的結(jié)果，考察QAMS的準(zhǔn)確性與科學(xué)性，為合理評價壯藥三加皮藥材的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，同時為進(jìn)一步研究三加皮酚酸類成分、推廣三加皮的藥用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters e2695 UV高效液相色譜系統(tǒng)(美國 Waters 公司),Agilent 1260 高效液相色譜系統(tǒng)(美國 Agilent 科技有限公司),Shimadzu LC-2030 Plus 高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；色譜柱：phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5 μL)及Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μL)，Mettler Toledo XS105DU電子分析天平，KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，密理博超純水機(jī)(廣西南寧市博美生物科技有限公司)。

對照品綠原酸(批號110753-201817，純度≥96.8%)，購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸(批號DST190124-015，純度≥98%)，異綠原酸B(批號DST190226-037，純度≥99.04%)，異綠原酸A(DST190113-036，純度≥99.5%)，異綠原酸C(DST190110-038，純度≥99.47%)，均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，其余為分析純，水為超純水。

10批三加皮藥材信息見表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱意麟高級鑒定師鑒定，均為五加科植物三加皮Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.的干燥根。

表1 壯藥三加皮樣品信息Table 1 Sample information of Zhuang medicine Acanthopanax trifoliatus(L.)Merr.

1.2 方法

1.2.1 HPLC法色譜條件

色譜柱：phenomenex C18(4.6 nm×250 nm×5 μm)；流動相：乙腈(C)-0.2%磷酸溶液(A)，梯度洗脫(0-6 min，9.5% C；6-15 min，13% C；15-18 min,14% C；18-20 min，15% C；20-30 min，18% C；30-45 min，30% C；45-50 min，35% C)；流速：1 mL/min；檢測波長：325 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL。以上述色譜條件下三加皮樣品及混合對照品的色譜圖見圖1。

1.新綠原酸；2.綠原酸；3.異綠原酸B；4.異綠原酸A；5.異綠原酸C1.neochlorogenic acid；2.chlorogenic acid；3.isochlorogenic acid B；4.isochlorogenic acid A；5.isochlorogenic acid C圖1 混合對照品(a)和三加皮樣品(b)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference (a) and Acanthopanax trifoliate sample (b)

1.2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，加50%甲醇溶解，分別制成濃度為1.03,1.55,1.16,1.01,1.21 mg/mL的對照品溶液；另取上述溶液適量，置于同一量瓶中，加50%甲醇稀釋，制成含新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的濃度分別為0.019,0.390,0.200,0.033,0.060 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取三加皮粉末約0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇30 mL，稱重，超聲30 min，冷卻，補(bǔ)重，加50%乙醇補(bǔ)足減失重量，過濾，取續(xù)濾液15 mL，揮干，用50%乙醇定容至5 mL，搖勻，離心，取上清液，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC定量方法的建立

2.1.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取1.2.2節(jié)的混合對照品溶液1，3，5，8，10，15，20 μL，按1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄5個成分的峰面積值，以峰面積(y)對應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量x(μg)進(jìn)行回歸分析。得各回歸方程及線性范圍(表2)。

表2 5種酚酸類成分線性回歸方程Table 2 Linear regression equations of 5 phenolic acids

2.1.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液5 μL，按1.2.1節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算得到新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C峰面積的精密度RSD值分別為0.05%、0.07%、0.39%、0.06%、0.75%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批三加皮供試品粉末，精密稱定，按照1.2.3節(jié)的方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取5 μL進(jìn)樣測定，分別計(jì)算新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C 5個成分平均含量及其RSD值，結(jié)果得到新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C 5個成分平均含量分別為1.038，16.320，1.840，17.360，5.519 mg/g，RSD值分別為1.1%、2.4%、2.1%、2.4%、2.4%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份三加皮供試品溶液5 μL，分別于制備后0，2，4，6，8，12 h進(jìn)行測定，分別計(jì)算新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C 5個成分峰面積值，計(jì)算RSD值，結(jié)果分別為0.90%、0.22%、1.20%、0.39%、1.30%，表明該供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量三加皮樣品粉末，精密稱定6份，每份約0.25 g，分別精密加入一定量的新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對照品，按1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，分別測定其峰面積，計(jì)算回收率。新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的平均回收率分別為100%、105%、98%、103%、104%；RSD值分別為2.31%、2.24%、1.90%、1.07%、1.43%，表明該方法的準(zhǔn)確度很高。

2.2 相對校正因子的計(jì)算

分別精密吸取1.2.2節(jié)的混合對照品溶液1，3，5，8，10，15，20 μL測定，以綠原酸為內(nèi)參物(S)，按照公式(1)計(jì)算新綠原酸(a)、異綠原酸B (b)、異綠原酸A (c)、異綠原酸C (d)的相對校正因子，結(jié)果見表3。

表3 壯藥三加皮一測多評法測定5個酚酸類成分的相對校正因子fi/STable 3 Relative correction factors fi/S for the determination of 5 phenolic acids components in Zhuang medicine Acanthopanax trifoliatus(L.)Merr.by QAMS method

(1)

其中，Ai、AS分別為待測成分及內(nèi)參物的峰面積，Wi、WS分別為待測成分及內(nèi)參物的量。

2.3 相對校正因子(fi/S)的耐用性考察

2.3.1 不同高效液相色譜系統(tǒng)及色譜柱對fi/S的影響

精密吸取1.2.2節(jié)的混合對照品溶液5 μL測定，分別考察Waters e2695 UV、Agilent 1260及Shimadzu LC-2030 Plus 3種色譜儀和phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μL)及Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μL) 2種色譜柱對相對校正因子的影響，并計(jì)算RSD值，結(jié)果均小于3%(表4)，表明該法重現(xiàn)性良好。

表4 不同色譜儀器和色譜柱下測得的相對校正因子fi/S (n=3)Table 4 Relative correction factors fi/S(n=3) measured under different chromatographic instruments and columns (n=3)

2.3.2 不同色譜柱柱溫對fi/S的影響

考察不同柱溫(25，30，35℃)對各fi/S的影響。新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的RSD值依次為0.76%、0.79%、0.08%、0.80%(表5)，表明柱溫波動對各相對效正因子fi/S無顯著影響。

表5 不同柱溫對相對校正因子fi/S的影響Table 5 Effects of different column temperatures on relative correction factors fi/S

考察不同流速(0.6，0.8，1.0 mL/min)對各fi/S的影響。新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的RSD值依次為0.76%、0.79%、0.08%、0.80%(表6)，表明不同流速對各相對校正因子fi/S無顯著影響。

表6 不同體積流量對相對校正因子fi/S的影響Table 6 Effects of volume flow rate on relative correction factors fi/S

2.4 待測成分色譜峰的定位

本研究考察了對不同色譜柱中各待測色譜峰與參照物峰的保留時間差(⊿ti/S)及相對保留時間(ti/S)進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)⊿ti/S及ti/SRSD值均小于5%，⊿ti/S波動較小(表7，8)，因此，采用⊿ti/S對待測組分色譜峰進(jìn)行定位。

表7 不同色譜柱下待測成分的色譜峰定位(⊿ti/S法,n=3)Table 7 Chromatographic peak location for the components to be tested under different chromatographic columns (⊿ti/S method,n=3)

2.5 QAMS與ESM測定結(jié)果的比較

取10批產(chǎn)地的三加皮樣品，按照1.2.3節(jié)方法制備樣品溶液，按照1.2.1節(jié)的色譜條件測定，記錄待測組分峰面積，分別用ESM法與QAMS法計(jì)算其含量并對結(jié)果進(jìn)行比較，其相對誤差RE均小于3%(表9)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，結(jié)果表明，P=0.000 0<0.05，2種方法所得值無顯著性差異，由此說明QAMS法用于三加皮藥材的多種酚酸類成分質(zhì)量評價研究是可行的。

表8 不同色譜柱下待測成分的色譜峰定位(ti/S法,n=3)Table 8 Chromatographic peak location for the components to be tested under different chromatographic columns (ti/S method,n=3)

表9 QAMS法與ESM法測得10批三加皮中5種酚酸的含量(n=3) Table 9 Content of 5 phenolic acids in ten batches of Acanthopanax trifoliatus(L.)Merr.by QAMS and ESM (n=3)

3 討論

目前有文獻(xiàn)報道三加皮根部總黃酮提取工藝[15]，但對三加皮質(zhì)量控制研究甚少，因此，本研究采用HPLC法，建立一測多評法(QAMS)對三加皮中酚酸類成分含量進(jìn)行測定。

本研究考察了不同柱溫、流速、色譜柱、儀器對所建立的校正因子的影響，結(jié)果表明各成分的校正因子重現(xiàn)性良好。QAMS旨在通過某一參照物峰實(shí)現(xiàn)對其他待測色譜峰的準(zhǔn)確定位，常規(guī)方法通過保留時間差(⊿ti/S)或相對保留時間(ti/S)定位，通過保留時間差或相對保留值等參數(shù)不能準(zhǔn)確定位時，選用定性用的對照品對待測組分色譜峰進(jìn)行定位[17]。本研究應(yīng)用保留時間差(⊿ti/S)或相對保留時間(ti/S)對各成分的色譜峰進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)⊿ti/S及ti/S在不同儀器和色譜柱中重現(xiàn)性較好，同時結(jié)合色譜峰峰型，可準(zhǔn)確對目標(biāo)峰的位置做出判斷。研究測定了10批三加皮中的5個成分，結(jié)果顯示QAMS與ESM的統(tǒng)計(jì)結(jié)果無顯著性差異，說明選擇綠原酸為內(nèi)參物，可建立QAMS法用于三加皮藥材質(zhì)量控制。

如何有效建立穩(wěn)定有效的對中藥可控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一直是熱門探討話題，中藥多成分的復(fù)雜性決定了單一成分或指標(biāo)測定難以評價中藥的質(zhì)量，由此提出多成分質(zhì)量控制的模式，并可直接對藥材進(jìn)行質(zhì)量評價。本研究通過一測多評法對多指標(biāo)成分的測定反應(yīng)三加皮的質(zhì)量，酚酸類成分是三加皮主要活性成分之一，但新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對照品昂貴，而綠原酸對照品價廉易得，化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，在10批三加皮藥材中含量較高，是三加皮的主要活性成分之一，所以選擇綠原酸為內(nèi)參物進(jìn)行QAMS分析。通過外標(biāo)法測定綠原酸，用相對校正因子來計(jì)算新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 4種成分的含量，與外標(biāo)法測定結(jié)果相比較，結(jié)果無顯著差異，檢測方法快速、簡便、準(zhǔn)確。一測多評法同步測定綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 5種成分的含量，符合多成分測定，不僅可全面控制三加皮的質(zhì)量，解決對照品價格昂貴難獲得的問題，降低檢測成本，還可為三加皮質(zhì)量控制提供多成分指標(biāo)評價模式，對進(jìn)一步利用三加皮資源及研究其保健作用和藥用價值提供科學(xué)參考，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

此外，課題組采用高效液相色譜與Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，考察不同產(chǎn)地的三加皮成分，借助賽默飛中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫OTCML分析，但在HPLC法測定其含量時，三加皮樣品中有的色譜峰跟實(shí)驗(yàn)室的對照品沒有對應(yīng)上，在有關(guān)三加皮的研究文獻(xiàn)上也沒有指認(rèn)出。本課題組今后會進(jìn)一步對三加皮活性成分及藥理藥效進(jìn)行深入的研究，為三加皮的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供科學(xué)依據(jù)。