根際促生細菌對1年生樟子松生長及土壤理化指標的影響1)

羅佳煜 宋小雙 鄧勛 宋倩 王俊凱 王子卓 宋瑞清

(東北林業大學，哈爾濱，150040) (黑龍江省森林保護研究所) (東北林業大學)

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)是歐洲赤松的一種地理品種，自然分布在中國大興安嶺山區、中國呼倫貝爾沙質平原紅花爾基、俄羅斯和蒙古部分地區，具有耐寒、耐旱、適應性強、生長快等特點。它是目前我國“三北防護林計劃”和“治沙工程”中使用的主要針葉樹種，在生態建設和環境恢復中發揮著重要作用。

林業苗圃生產中，化學肥料和農藥的大量使用掩蓋甚至阻礙了土壤微生物對植物營養的影響和貢獻，造成植物根際土壤微生物多樣性降低，功能單一化，減少使用化學農藥和肥料，強調根際微生物對植物的促生抗逆作用，多使用微生物菌肥的，對于保障農林業的可持續發展意義重大[1]。植物根際是植物與土壤環境互作的界面，大量的微生物生活在植物根際區域，它們的生長會受到植物根系分泌物的影響[2]。植物根際微生物組群體高度復雜，被認為是植物的“第二基因組”，其中細菌的數量和種類最為豐富[3-4]。植物根際微生物能夠很大程度的影響植物生長，并且在抵抗病原物對植物的侵染方面具有重要作用。當植物受到病原物侵襲時，植物可以從土壤中募集具有拮抗作用的微生物[5]。1978年，美國奧本大學Kloepper首次提出Plant Growth-Promoting Rhizobacteria(PGPR)的概念：定殖于植物根際，能夠促進植物生長的一類細菌[6]。目前，研究較為廣泛的包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)等[7]。PGPR可通過固氮、溶磷、產生鐵載體及分泌植物激素等作用機制促進植物生長，如在減少肥料施用量的條件下，解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefacuens)和短小芽孢桿菌(B.pumilus)能夠促進番茄的生長及對N素的吸收[8]。韋建玉[9]等得出施加微生物菌肥可提高植物土壤基本養分含量，改善物理性狀，增加微生物量，對種子的育苗或種植都有促進作用[10]。本研究通過接種不同PGPR菌株，測定樟子松1年生苗生物量、營養指標，土壤理化性質和酶活性的質量濃度，分析研究PGPR菌株對樟子松1年生生長及土壤理化指標的影響，為植物PGPR菌肥改善土壤環境、促進苗木生長、降低病害發生，以“菌化苗”形式在后續造林中提高苗木成活率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樟子松根際土壤樣品采集及細菌分離

樟子松根際土壤樣品采自東北林業大學哈爾濱實驗林場樟子松1年生苗，挖出根系后，采用抖土法獲得根際土樣品，過60目篩后冰箱4 ℃保存。細菌分離采用梯度稀釋法，將樟子松根際土壤梯度稀釋液分別涂布于TYG、TSB、YEM、M408、M715以及TWYE6種不同培養基平板，28 ℃黑暗條件下培養5 d，挑取不同形態的菌落，進行劃線純化，將獲得的根際細菌保存到R2A液體培養基中，放置于冰箱中4 ℃保存。

1.2 樟子松根際促生細菌篩選

樟子松根際IAA產生菌采用Salkowski比色劑定性篩選，采用IAA標準曲線法進行定量篩選，產鐵載體菌株采用CAS平板法定性篩選，解磷細菌采用NBRIP培養基定性篩選，鉬銻抗比色法定量篩選[11]。

1.3 根際促生細菌16SrRNA基因測序

將分離純化的細菌接種于1 mL LB培養基中，30 ℃，200 r·min-1振蕩培養24 h后12 000 r·min-1離心5 min后，去掉上清液，加入PCR體系：10×擴增緩沖溶液5.0 μL，d NTP引物1 μL，上下游引物(10～20 pmol)各2 μL，Taq DNA聚合酶(10 U/μL)1 μL，加超純水至50 μL。采用細菌16S rRNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行16S rRNA基因的PCR擴增。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到PCR擴增產物，樣品送上海美吉生物進行測序分析。

1.4 根際促生細菌對樟子松1年生苗的接種效應

1.4.1 PGPR接種菌劑制備

將-20 ℃保存的前期試驗篩選得到PGPR菌株劃線接種到牛肉膏蛋白胨(NB)固體培養基上，30 ℃黑暗條件下培養72 h后，挑取單菌落接種到牛肉膏蛋白胨(NB)液體培養基中(28 ℃，180 r·min-1)振蕩培養48 h后，4 ℃條件下8 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液后無菌水沖洗3次，接種前調整終濃度OD600吸光度為0.6。

1.4.2 樟子松育苗

V(草炭土)∶V(蛭石)∶V(河沙)=2∶1∶1混合配制成育苗基質土壤，121 ℃下高溫高壓滅菌2 h，裝入營養缽(15 cm×13 cm)中室溫放置7 d后進行播種[12]。樟子松種子催芽后播入營養缽中，每缽播30粒種子，置于東北林業大學實驗林場溫室中培養，幼苗出土后，每缽定苗至15株。進行常規的日常管護[13]。

1.4.3 接種試驗設計

樟子松出苗14 d后進行接種，共2個接種方式：1)CK為PD培養基作為對照；2)單接種PGPR菌株；采取打孔灌根方式接種，每盆PGPR菌株菌劑、PD培養基50 mL(即每盆打直徑10 mm、深5 cm的5個小孔，注入菌劑)。共7個處理，每個處理20次重復(即每個處理20盆300株樟子松1年生苗)，共140盆，接種完成后在溫室中正常管護。

1.4.4 樟子松1年生苗取樣

植物取樣：接種處理90 d，苗木渡過生長期后取樣植物，用于測定指標。每個處理隨機取1年生苗100株，用無菌水清洗根際，濾紙吸干后用于指標測定。

根際土取樣：每處理采集樟子松苗的同時，輕輕抖動根際土收集于無菌樣品袋中，過2 mm篩后放入裝有冰袋的保溫箱中帶回實驗室，用于測定土壤養分指標的風干后常溫保存；測定土壤酶指標的土壤在冰箱4 ℃保存。

1.4.5 植物生長指標測定

1)生物量指標：分別測定1年生苗的苗高、地徑、地上部分及地下部分鮮質量，干燥箱85 ℃烘干后測定地上部分及地下部分干質量。

2)苗木養分指標：樟子松1年生苗烘干后分為根、莖、葉3部分，研磨成粉狀用于測定植物營養成分，包括全氮、全磷、全鉀、有機質質量分數。全氮(TN)測定采用凱氏定氮儀(K9840)；全磷(TP)的測定采用Mo-Sb比色法；全鉀(TK)采用火焰光度計法測定；有機質(OM)測定采用重鉻酸鉀外加熱法測定[21]。

1.4.6 土壤指標測定

1)土壤酶活性測定：采用南京建成生物土壤酶測定試劑盒，按照說明書測定土壤酸性磷酸酶活性、過氧化氫酶活性、蔗糖酶活性及脲酶活性含量。

2)土壤養分指標：全氮(TN)的測定采用凱氏定氮法；速效氮(AN)用堿性水解法測定；全磷(TP)的測定采用Mo-Sb比色法；速效磷(AP)的測定采用雙酸浸出的鉬銻抗比色法；總鉀(TK)的測定采用火焰光度計；速效鉀(AK)的測定采用乙酸銨(CH3COONH4)浸提劑火焰光度計；用重鉻酸鉀氧化加熱法測定有機質(OM)。

1.5 數據處理和分析

序列測定結果利用BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)與GenBank數據庫中的序列進行比對分析，選取同源性較高的相關序列用MEGA4.1軟件(http://www.megasoftware.net/mega4.1.html)分析，用鄰接法構建系統發育樹，自展數(bootstrap)為1000。植物和土壤指標測定數據采用Excel 2019進行初步處理，數據由平均值±標準誤表示；每個指標設置3個重復，使用SPSS19.0進行單因素方差分析，使用Origin2019處理數據并繪圖。

2 結果與分析

2.1 樟子松根際PGPR菌株篩選

從樟子松1年生苗根際土壤分離純化得到215株細菌，通過產IAA能力、解磷作用、產鐵載體的定性和定量篩選，得到6株高效的PGPR菌株(表1)，其中菌株2-6、3-13產IAA能力較強，IAA質量濃度分別為68.41、67.79 mg/L；菌株1-11、1-12解磷能力較強，磷質量濃度分別為96.5、86.17 mg/L；菌株1-42、6-13產鐵載體能力較強。

表1 樟子松根際PGPR菌株定性和定量篩選

2.2 樟子松根際PGPR細菌的16SrRNA基因測序分析

將篩選所得根際細菌的16S rRNA基因序列與Genbank對比分析，其中1-11、1-42與Pseudomonasfluorescens(MK100909.1、MH518308.1)同源性為100%，1-12與Ralstoniapickettii(GQ895735.1)同源性為100%，2-6與Herbaspirillumchlorophenolicum(NR114143.1)同源性為100%，3-13與Staphylococcuscapitis(JX094948.1)同源性為100%，6-13與P.lini(MH304256.1)同源性為100%。菌株測序序列上傳Genbank并編號：P.fluorescens(MK880640)1-11、R.pickettii(MK880641)1-12、P.fluorescens(MK880644)1-42、H.chlorophenolicum(MK880645)2-6、S.capitis(MK880646)3-13、P.lini(MK880647)6-13，菌株保存于東北林業大學森林微生物實驗室。

2.3 PGPR接種對樟子松苗生物量指標的影響

不同接種處理對樟子松苗生物量的影響差異顯著(p<0.05)，同對照相比，1-42處理組顯著增加了樟子松的根長、地上部鮮質量、地下部鮮質量、地下部干質量，分別增加了66.33%、86.73%、76.57%、64.46%，3-13處理組顯著增加樟子松的根長，增加了52.51%；1-11處理組顯著增加了樟子松的根長、地下部鮮質量，分別增加了70.81%、81.95%；2-6處理組顯著增加了樟子松的根長、地上部鮮質量，分別增加了26.62%、11.50%；6-13處理組顯著增加了樟子松的根長，增加了42.66%(表2)。綜合分析，PGPR處理組對樟子松1年生苗根長的影響最為顯著，平均增加了46.67%，且PGPR菌株1-42對樟子松苗生物量指標影響最為顯著，說明接種PGPR可通過促進苗木根系生長，從而影響苗木生長。

圖1 樟子松根際PGPR菌株16SrRNA基因系統進化樹

表2 接種PGPR的樟子松1年生苗生物量

2.4 PGPR接種對樟子松苗養分指標的影響

不同接種處理對樟子松苗養分指標的影響差異顯著(P<0.05)，同對照(CK)相比，不同接種處理的樟子松苗在全氮、全磷、有機質、全鉀水平均有顯著增加，其中1-11處理組顯著增加了樟子松苗根、葉全氮質量分數，分別增加了33.63%、60.38%，2-6處理組顯著增加了樟子松苗莖的全氮質量分數，增加了44.53%，不同接種處理樟子松苗的根、莖、葉全氮質量分數平均增加1.62%、16.58%、30.19%；不同接種處理對樟子松苗的全磷影響最為顯著，根、莖、葉全磷質量分數平均增加89.26%、206.23%、178.67%；6-13處理組顯著增加了樟子松苗根、莖、葉的有機質質量分數，分別增加了30.64%、35.77%、48.11%；不同接種處理對樟子松苗根和莖的全鉀質量分數平均增加了41.03%、16.44%，但樟子松苗葉的全鉀質量分數不增反降。

表3 接種PGPR的樟子松1年生苗養分

2.5 PGPR接種對樟子松苗根際土壤養分和酶活性的影響

不同處理組對樟子松苗根際土壤速效氮、全磷、速效磷、有機質質量分數以及磷酸酶活性、過氧化氫酶活性、蔗糖酶活性、脲酶活性的影響差異顯著(P<0.05)，但在全磷和速效磷水平上沒有顯著差異性(P>0.05)，PGPR處理組土壤全氮、速效鉀質量分數與對照(CK)相比均出現降低的情況；其中3-13處理組對土壤中全磷、速效磷、有機質質量分數及蔗糖酶活性、脲酶活性的量有顯著影響，分別增加了38.30%、29.14%、36.19%、10.36%、43.96%；1-11處理組對土壤速效磷、全鉀質量分數及蔗糖酶活性、脲酶活性有顯著影響，分別增加了6.04%、3.47%、11.96%、32.09%；1-12處理組對速效氮、速效磷質量分數以及過氧化氫酶活性有顯著影響，分別增加了30.77%、49.63%、4.05%；2-6、6-13處理組對蔗糖酶活性、脲酶活性有顯著影響，2-6處理組分別增加了24.17%、31.16%，6-13處理組分別增加22.44%、46.92%；綜合分析，PGPR處理組對脲酶活性影響最顯著，增長率均達到20.03%以上。

表4 不同樣品接種PGPR的樟子松根際土壤養分及酶活性

樣品速效鉀質量分數/mg·kg-1磷酸酶/U·g-1過氧化氫酶/U·g-1蔗糖酶/U·g-1脲酶/U·g-11-11(87.43±0.21)c (962.96±44.1)d (414.12±36.4)cd(184.73±9.4)abc(1069.75±111.0)ab1-12(91.02±0.15)b(1213.80±44.0)c(526.70±37.5)a(200.20±12.9)ab(972.11±147.0)ab1-42(87.50±0.37)c(1538.72±73.6)a(453.24±18.4)bc(183.31±1.0)bc(1015.67±140.3)ab2-6(86.72±0.42)cd(1314.81±76.5)bc(434.63±7.3)cd(204.88±7.8)a(1062.24±46.1)ab3-13(86.51±0.42)de(1320.71±41.2)bc(384.07±11.8)d(182.09±9.0)bc(1165.88±95.9)a6-13(85.88±0.54)e(1186.87±145.3)c(458.96±41.0)bc(202.03±11.3)ab(1189.91±286.5)aCK(98.07±0.10)a(1519.36±144.4)ab(506.19±26.3)ab(165.00±5.6)c(809.89±76.8)b

2.6 土壤理化性質與樟子松苗生物量的相關性

由表2—4可知，土壤中的全氮質量分數對幼苗地徑和地下干質量有顯著影響；速效氮、速效鉀質量分數對幼苗地下鮮質量有顯著影響；有機質質量分數對地下干質量有顯著影響；土壤中磷酸酶活性對幼苗地上鮮質量和干質量有顯著影響；過氧化氫酶和蔗糖酶活性對幼苗地下鮮質量有顯著影響；土壤全磷、速效磷質量分數和脲酶活性與幼苗生物量相關性不太。

表5 土壤理化性質與生物量的相關性

3 結論與討論

通過篩選樟子松根際分泌IAA細菌、解磷細菌、產鐵載體細菌菌株得到6株復合PGPR菌株，經16SrRNA基因測序分析鑒定，分別為1-11菌株(PseudomonasfluorescensMK880640)、1-12菌株(RalstoniapickettiiMK880641)、1-42菌株(P.fluorescensMK880644)、2-6菌株(HerbaspirillumchlorophenolicumMK880645)、3-13菌株(StaphylococcuscapitisMK880646)、6-13菌株(P.liniMK880647)。這與徐秀倩等人研究發現林木根際細菌JYZ-SD5具有固氮、解有機磷和解鉀的能力，具有較高的產IAA能力，不加色氨酸前體下產IAA量為6.818 6 μg/mL的結論一致[14]。同時Yasmi等發現具有固氮、解磷和產IAA能力的兩種細菌Exiguobacteriumsp.和Stenotrophomonassp.對卡琪花蒂瑪(Labisiapumila)有促生作用[15]。

接種PGPR對樟子松1年生具有促生作用，可提高根際土壤養分和土壤酶活性。本實驗PGPR菌株1-42和3-13對樟子松生物量指標的影響最為顯著；接種PGPR后樟子松苗根長同對照相比，平均增加了46.67%。有實驗證明NaCl脅迫下，接種PGPR的燕麥的株高、根長、莖干質量、根干質量、相對含水量等生物參數明顯高于未接種的植株[16]；牛旭光[17]等人發現耐旱熒光假單胞菌(P.fluorescens)可刺激干旱脅迫下的種子萌發和幼苗生長。同時耿士均等研究發現，土壤中施加1.0%～2.5%的微生物菌肥可以使辣椒株高、干質量分別增加3.0%～44.9%、16.7%～67.8%；番茄株高、干質量分別增加6.2%～69.9%、3.8%～275.0%[18]。童輝[19]等研究表明，微生物菌肥施用量為2.0%時辣椒株高、生物量分別較對照增加15.8%、80.5%。

接種PGPR可顯著提高樟子松1年生苗全氮、全磷、有機質、全鉀質量分數，其中PGPR接種對樟子松1年生苗全磷質量分數影響最為顯著。PGPR菌株1-11對根、葉的全氮質量分數有顯著影響；菌株2-6對莖的全氮質量分數、根的全鉀質量分數有顯著影響；菌株1-12對根、葉的全磷質量分數有顯著影響；菌株1-42對莖的全磷質量分數，莖、葉的全鉀質量分數有顯著影響；菌株6-13在根、莖、葉對有機質質量分數有顯著影響。菌根菌主要作用為提升植物攝取土壤內磷元素能力，攝取機制為借助菌絲將養分空間擴大，并將土壤內部有機質活化[20]。植物與土壤微生物間產生密切的關聯，其植物有機質為微生物提供賴以生存的環境，而微生物通過分解有機質、釋放礦化元素促進植物更好地生長[21]。

微生物在土壤內存在，可將其中難溶礦物質加以分解，成為易溶解化合物，其中以磷、鉀等細菌為主，其可釋放無效的磷、鉀等物質，加速植物發育、成長等[22]。本實驗證明接種PGPR可顯著提高樟子松1年生苗土壤速效氮、全磷、速效磷、有機質質量分數以及磷酸酶活性、過氧化氫酶活性、蔗糖酶活性、脲酶活性，但在全磷和速效磷水平上沒有顯著差異性，且接種PGPR的樟子松1年生苗土壤全氮、速效鉀質量分數與對照(CK)相比均出現降低的情況；這與呂俊[23]等人在植物根際促生菌對大蒜的促生、抗病作用的研究中發現，8 g處理組的發芽率、株高、葉綠素質量分數以及銨態氮、有效鉀和速效磷等土壤養分含量的測量都出現了降低的情況相同，可能是在較高濃度功能菌的情況下會出現促進作用下降的情況，也可能與植物根際促生菌本身或者其代謝產物過多有關。李靜[24]等的研究通過對各處理土壤的分析，得出固氮菌+解磷菌+解鉀菌組合的綜合應用有利于多功能菌增加土壤養分含量。

本實驗證明土壤中的全氮質量分數、速效氮質量分數、速效鉀質量分數、有機質質量分數、磷酸酶活性、過氧化氫酶活性和蔗糖酶活性與幼苗生物量顯著相關。土壤全磷質量分數、速效磷質量分數和脲酶活性與幼苗生物量相關性不太。這與陳有軍等人[25]在研究植物養分含量和根際土壤微生物量的動態變化一致，植物氮的單位含量和根際土壤的微生物量氮有相關性，但是只是植物地下部分單位氮含量和根際土壤微生物量碳、氮、磷呈正相關，且極顯著。