GGR-6對米槁插穗生根過程中生理動態的影響1)

劉歡 劉濟明 駱暢 唐子燕 梁格林 代麗 李如琪

(貴州大學，貴陽，550025)

米槁(CinnamomummigaoH. W. Li)是樟科樟屬的1種高大喬木，成年株高可達25 m，是我國西南部少數民族地區的特有植物種，也是貴州省苗族的代表性藥用植物，具有重要的生態、經濟、科學研究價值[1]。隨著以米槁藥材為原料的貴州民族藥品的開發、應用，米槁資源的需求量不斷增大[2]。目前，種子繁殖是米槁良種生產繁育最主要的方法，但野生米槁種子的保存完好率、萌發率較低[3]，種子育苗不能滿足市場需求，故急需開拓新的繁殖技術，填補米槁資源緊缺的空白。近年來，對米槁的研究多集中在藥林間作[4]、自然更新[5]、果實揮發油[6]等方面，鮮少有對米槁無性繁殖的研究。基于此，本研究選取最適合米槁扦插生根的生長調節劑GGR-6及其最適質量分數，以米槁1年生嫩枝穗條為試驗材料，通過對比分析GGR-6處理插穗生根過程的生理動態變化，探究其扦插繁殖的生根機制，為提高米槁繁殖率、加速苗木繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為貴州省種源米槁，所用扦插穗條取自貴州省羅甸縣逢亭鎮逢亭村米槁育苗基地2年生米槁實生苗。選取生長健壯、無病蟲害的米槁1年生枝條，用穗條的中部制穗，每插穗留1～2片1/2葉。試驗扦插基質為珍珠巖。于2016年6月—10月在貴州大學林學院苗圃進行米槁扦插試驗。

1.2 試驗處理

對扦插基質進行消毒，插前插穗用30 mg·L-1的GGR-6生長調節劑浸泡4 h，同時以清水浸泡插穗作為對照(CK)。采用隨機區組設計，每個處理重復3次，每個重復30根插穗。從開始扦插后每隔10 d每個重復隨機抽取足量插穗，直至插后60 d，共采集7次。采集樣品需小心地從基質內拔出插穗，蒸餾水沖干凈后擦干迅速帶回，將各重復的插穗基部韌皮部剝下并經過液氮處理后磨碎裝入離心管，于冰箱-20 ℃保存[7]。

1.3 扦插后管理

扦插后使用遮陰網將光強控制在自然光照的60%左右，扦插溫度控制在25～30 ℃，空氣濕度控制在80%以上。每隔10 d噴灑1 000 mg·L-1的多菌靈溶液進行滅菌，并對扦插苗進行常規管理。

1.4 米槁生根過程相關生理指標的測定

對試驗樣品進行營養物質、酶活性、內源激素的測定。采用蒽酮比色法測定可溶性糖、淀粉質量分數，采用考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白質量分數[8]。參照蔡楚恒[9]的方法測定過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)的活性。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)進行內源激素的測定。測定前將保存于-20 ℃冰箱中的樣品取出0.5 g，用液氮磨碎，裝入10 mL離心管中，再加入2 mL提取液分次將研缽沖洗干凈，全部轉入離心管中，在4 ℃條件下10 000 r·min-1離心10 min，取上清液轉入10 mL離心管，用干冰及泡沫箱送至成都百奧諾維生物科技有限公司進行內源激素質量分數的測定。用插穗中吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)的質量分數及IAA與ABA質量分數比值、IAA與ZR質量分數比值評定米槁插穗的生根能力。

1.5 數據分析

試驗數據均采用平均值±標準誤(n=3)表示，使用Excel2013、Origin2018進行數據統計及圖表繪制，利用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法進行LSD檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 米槁插穗生根過程中營養物質動態

2.1.1 可溶性糖質量分數變化

從圖1可以看出，在米槁插穗生根過程中，不同處理的可溶性糖質量分數變化趨勢基本一致，呈V字型。以扦插20 d為臨界點，插穗體內新陳代謝的加快使扦插的前20 d，2組不同處理的插穗可溶性糖質量分數持續下降，說明不定根形成時期需要消耗大量的可溶性糖為其提供能量。扦插20 d后，處理組的可溶性糖質量分數開始持續升高，對照組則在扦插30 d后呈現上升-下降-上升的變化。在扦插后的0～30 d，GGR-6處理的插穗體內可溶性糖質量分數始終低于清水對照組。扦插30 d后，不定根的形成使可溶性糖質量分數回升，但清水處理的插穗愈傷組織發育、生根速率低于對照組，因此又出現1次可溶性糖質量分數的下降，最終可溶性糖累積量低于對照組。

圖1 扦插過程中營養物質質量分數的變化

2.1.2 淀粉質量分數變化

米槁扦插后淀粉質量分數隨生根進程的變化而發生改變。在扦插的前30 d，由于愈傷組織形成及根原基發育需要淀粉分解形成可溶性糖提供能量，導致插穗體內的淀粉質量分數逐漸減少。在扦插后的0～20 d，GGR-6處理的插穗體內淀粉質量分數高于對照組。在扦插后20～30 d，2種處理的插穗體內淀粉質量分數相近。扦插后的30～50 d，不定根形成使插穗體內的淀粉質量分數開始回升。扦插50 d后，不定根的增多、伸長、生長使插穗體內的淀粉被消耗。在這期間，處理組的淀粉質量分數始終低于對照組，并在40 d時到達最低值，說明GGR-6處理促進了插穗根原基的發生及不定根的生長。

2.1.3 可溶性蛋白質量分數變化

米槁插穗生根過程中，插穗體內可溶性蛋白質量分數呈現下降-上升的規律，與可溶性糖質量分數的變化趨勢一致，為V字型。在扦插的前40 d，愈傷組織與根原基的形成過程消耗了大量的營養物質，導致可溶性蛋白質量分數持續下降。扦插40 d后，插穗體內可溶性蛋白質量分數開始逐漸上升。在扦插后的40～50 d，可溶性蛋白大量積累，為不定根的生長提供了物質基礎。扦插50 d后，不定根數量的增多及其增粗生長使可溶性蛋白被分解，導致插穗中的可溶性蛋白質量分數上升變緩。在整個扦插期間，清水對照組插穗體內的可溶性蛋白質量分數明顯低于處理組，說明GGR-6處理對插穗體內可溶性蛋白的合成有促進作用，加速了不定根的發生及生長。

2.2 米槁插穗生根過程中相關氧化酶的活性動態

2.2.1 POD活性變化

米槁插穗生根過程中，POD的活性隨扦插天數的不同呈規律性變化。GGR-6處理的插穗體內POD活性呈現上升-下降-上升的變化趨勢，在30 d時達到最低值。扦插初期，由于扦插環境的改變，插穗脫離母體后受到一定的損傷，導致POD活性升高；扦插中期，插穗逐漸適應扦插環境，POD活性開始下降。在之后的生根進程中，GGR-6處理組插穗的POD活性急劇上升，高于清水處理組，說明高活性的POD有利于不定根的形成。受插穗體內外源生長調節劑的影響，清水處理組的插穗POD活性小于GGR-6處理組。

2.2.2 PPO活性變化

從圖2可以看出，GGR-6處理組插穗體內的PPO活性在持續上升，清水處理組插穗體內的PPO活性變化曲線為上升-下降-上升的雙峰曲線，在扦插20 d時到達第1個峰值，隨后在經歷短暫時期的下降后又開始回升?？梢?，PPO活性隨插穗生根的進程呈現規律性變化。在扦插初期，插穗傷口導致PPO活性升高從而促進傷口愈合，清水處理組插穗的傷口對環境的應激反應更加劇烈，因此清水處理組插穗的PPO活性高于GGR-6處理組。在扦插30 d后，GGR-6處理組的PPO活性持續升高，利于插穗形成吲哚乙酸-酚酸復合物；清水處理組的PPO活性下降，導致生根較晚。在扦插40 d后，2個不同處理的插穗PPO活性均在升高，說明高活性的PPO有利于不定根的生長。

圖2 扦插過程中氧化酶活性的變化

2.2.3 IAAO活性變化

在扦插后的0～10 d內，插穗體內的IAAO活性降低，即分解IAA的能力降低，有利于插穗切口的愈合。在扦插后的10～30 d，2個不同處理的插穗體內IAAO活性逐漸升高后趨于平緩，這一時期清水處理組的IAAO活性高于GGR-6處理組。在扦插30 d后，GGR-6處理的插穗體內IAAO活性高于清水處理的，并在50 d時達到最大值。清水處理組插穗的IAAO活性在30 d時下降并維持在該水平直到試驗結束，這一階段是不定根形成、生長的關鍵時期，IAAO的活性越高，分解的IAA越多，從而誘導了根原基的形成。清水處理組插穗的IAAO活性低于處理，生長素質量分數過高，抑制了不定根的產生，即IAA對植物表現出低質量分數促進、高質量分數抑制。由此說明，IAAO活性大小能影響插穗不定根的發生。

2.3 米槁插穗生根過程中內源激素質量分數及其比值變化

2.3.1 IAA質量分數變化

IAA的質量分數變化曲線與IAAO活性變化曲線相似。GGR-6處理、清水處理2種不同處理的插穗體內IAA質量分數變化相反。GGR-6處理的插穗體內IAA質量分數呈上升-下降-上升趨勢，在扦插后20 d時達到最大值，此時愈傷組織開始出現；扦插后20～50 d，插穗體內的IAA質量分數開始持續下降，說明誘導根原基形成不定根的過程需要消耗大量的IAA。清水處理組插穗體內的IAA質量分數變化幅度較小。在扦插后0～30 d內，IAA質量分數緩慢下降；在扦插30 d時到達最低值，隨后又開始緩慢上升。插穗扦插成活后(50 d后)，2組處理的插穗體內IAA質量分數都快速上升。

2.3.2 ABA質量分數變化

在扦插初期，GGR-6處理的插穗體內ABA的質量分數下降，在扦插10 d時ABA質量分數最低；扦插后10～20 d，植物對環境的應激反應使插穗體內的ABA質量分數增加，營養物質得以積累，利于扦插成活；在扦插20 d以后，GGR-6處理組插穗體內的ABA質量分數持續降低，較低質量分數的ABA有利于愈傷組織的形成及不定根的發生。清水處理組的插穗ABA質量分數呈現上升-下降的規律，在40 d時達到最大值。扦插前期，清水處理組的插穗為了增強抗逆性，導致ABA質量分數增高；扦插40 d后，ABA的質量分數開始下降，這時出現不定根。清水處理組的ABA質量分數在扦插各時期均高于GGR-6處理組，不定根出現的時間比GGR-6處理組晚，說明ABA能抑制不定根的形成。

2.3.3 GA質量分數變化

清水處理的插穗體內GA質量分數變化趨勢與GGR-6處理的一致，但總體變化幅度小于GGR-6處理的。在扦插初期，插穗脫離了母體，植物細胞在新環境中生長緩慢，GA質量分數下降。扦插后0～10 d，清水處理組的GA質量分數下降幅度大于GGR-6處理組，并在扦插10 d時到達最低值。扦插后的10～30 d內，2種不同處理的插穗體內GA質量分數出現上升，在30 d時，達到了1個小高峰，這時愈傷組織開始出現。經歷短暫的上升后，GA質量分數再次下降，說明少量的GA有利于不定根的發生。在扦插40 d后，GA質量分數同IAA一樣，開始回升。40 d后屬于不定根的伸長期，說明這2種激素有促進不定根生長的作用。

2.3.4 ZR質量分數變化

插穗內的ZR質量分數呈現出下降-上升的動態變化。扦插初期，各處理插穗內的ZR質量分數均出現了下降，清水處理組降低的幅度大于GGR-6處理組。在扦插后10～20 d，GGR-6處理、清水處理2種不同處理的插穗體內ZR質量分數有一次短暫的上升。扦插30 d前，GGR-6處理組插穗內的ZR質量分數一直高于清水處理組，這一時期愈傷組織開始形成，在GGR-6生長調節劑的作用下，ZR的合成加強，促進了愈傷組織的形成。清水處理組插穗內的ZR質量分數從扦插30 d開始快速上升，GGR-6處理組的從40 d開始平緩升高但低于清水處理組，說明插穗體內ZR質量分數較高，對不定根的形成有抑制作用，從而導致清水處理組的插穗生根晚于處理組。

2.3.5 激素比值變化

從圖3可以看出，扦插初期插穗對環境的抗逆反應使ABA質量分數上升，導致扦插后40 d內2組不同處理的插穗體內IAA與ABA質量分數比值均持續下降。GGR-6處理的插穗IAA與ABA質量分數比值在0～10 d有短暫的上升，說明外源植物生長調節劑有利于插穗體內IAA的積累，較高的IAA與ABA質量分數比值有利于愈傷組織的形成。插穗體內的IAA與ABA質量分數比值在扦插后的10～20 d，經歷短暫下降后保持平穩。扦插40 d后，不同處理的插穗體內IAA與ABA質量分數比值逐漸上升。在扦插不同時期，GGR-6處理組插穗內的IAA與ABA質量分數比值均高于清水處理組，說明高IAA與ABA質量分數比有利于插穗生根。

圖3 扦插過程中內源激素質量分數及比值變化

在米槁插穗生根過程中，GGR-6處理組插穗的IAA與ZR質量分數比值與清水處理組的變化趨勢一致，均呈現先上升后下降的波動變化，其中清水處理組插穗的IAA與ZR質量分數比值變化比較劇烈，出現2次高峰。在扦插20 d后，經GGR-6處理的插穗IAA與ZR質量分數比值高于清水處理組，同時GGR-6處理組插穗愈傷組織的形成早于清水處理組，說明IAA與ZR質量分數比值高有利于愈傷組織的形成。在扦插30 d后，插穗體內IAA與ZR質量分數比值開始下降并趨向于平穩變化，此階段為不定根的伸長生長階段。此階段插穗體內ZR的質量分數升高，使IAA與ZR質量分數比值降低?？傮w來看，GGR-6處理組的IAA與ZR質量分數比值高于清水處理組，說明IAA與ZR質量分數比值高對扦插生根有促進作用。

3 結論與討論

植物插穗內的營養物質是插穗生根前維持生命活動的重要能源，插穗內所儲存的可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白等營養物質對其生根具有重要影響[10]。愈傷組織的形成、根原基的發生、不定根的伸長及生長等生根過程需要消耗大量的營養物質。所以掌握扦插不同時期插穗體內營養物質的變化規律，有助于提高扦插生根效率[11]。本研究發現，在扦插初期(0～30 d)，插穗內的營養物質質量分數有所下降，說明插穗在生根前無法從土壤中吸收營養，只能通過消耗營養物質來維持生根過程中的各種生理活動。在不定根的形成、生長階段(40～50 d)，由于插穗不定根形成后從基質中吸收一定養分，并且伴隨新葉的產生，光合產物的增多，減少了體內營養物質的消耗，故插穗體內營養物質均有上升。插穗生根過程中可溶性淀粉質量分數在扦插50～60 d時下降，主要是由于不定根的伸長生長消耗了大量的營養、能量?？傮w來看，GGR-6處理組的插穗體內營養物質質量分數高于清水對照組，說明GGR-6預處理能加快米槁插穗的生根進程。因此，外源植物生長調節劑通過調節插穗的生理生化基礎促進插穗的愈傷組織形成及不定根生長進程，這與鄭巧巧等[12]的研究結果一致。

植物扦插過程中，酶類在生長、發育、不定根形成及其他新陳代謝中發揮著重要的作用，其中吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶、過氧化物酶的作用尤為顯著[13]。吲哚乙酸氧化酶通過分解吲哚乙酸、調節插穗體內吲哚乙酸質量分數影響插穗的生根進程。多酚氧化酶能夠催化酚類物質與吲哚乙酸快速縮合，形成1種吲哚乙酸-酚酸復合物，該復合物是1種生根輔助因子，對不定根的形成有顯著的促進作用[14]。多酚氧化酶通過氧化吲哚乙酸間接影響不定根的生長、伸長[15]。本研究發現，在扦插前期(0～30 d)，由于插穗的傷呼吸及對新環境的抗逆反應，且插穗具有低活性的吲哚乙酸氧化酶更利于愈傷組織的形成及生根[16]，從而導致了除了GGR-6處理組插穗的過氧化物酶活性在短暫的時間段高于清水處理組外，清水處理組插穗的氧化酶活性均高于GGR-6處理組。扦插30 d時是不定根形成的關鍵時期，GGR-6處理組插穗的3種氧化酶活性普遍高于清水處理組，說明經過外源生長素的處理，插穗酶活性的變化更利于生根[17]。

植物內源激素對難生根樹種的扦插生根起著重要作用，可以調節插穗內抗氧化酶和養分的動態變化，促進根原基的形成[18]。本研究測定了米槁插穗生根過程中的內源激素變化，研究結果顯示，米槁扦插生根過程中，吲哚乙酸質量分數呈現上升-下降-上升的變化規律。在扦插初期，外源生長素的作用使插穗基部生長素積累，吲哚乙酸質量分數上升，且插穗內高質量分數的吲哚乙酸能夠促進愈傷組織的形成。在愈傷組織形成時期，GGR-6處理的插穗吲哚乙酸、赤霉素質量分數均高于清水處理組，因此，GGR-6處理組插穗的生根早于清水處理組。插穗體內較低質量分數的脫落酸有利于愈傷組織形成及誘導根原基形成不定根，同時促進插穗內的淀粉水解為糖，為不定根的生長提供能量[19]。GGR-6處理組插穗在扦插初期的脫落酸質量分數下降，在根原基的形成、不定根發生進程中，脫落酸質量分數持續下降并趨于平穩。在扦插40 d后，不定根形成過程中，清水處理組的插穗體內脫落酸質量分數開始劇烈下降。玉米素核苷在生根前期一直波動變化，且有下降的趨勢，說明不定根的形成需要消耗玉米素核苷。插穗的不定根形成后，新根重新合成細胞分裂素[20]，導致玉米素核苷質量分數上升，以滿足插穗生根需要。在扦插生根過程中，插穗內源激素作用的發揮不是單一的，而是相互協同參與插穗生根的整個過程，不同激素質量分數比值的動態變化更能反映插穗的生根能力。本研究發現，高質量分數比的IAA與ABA與生根呈正相關，這與盧楠等[21]的研究結果一致。因此，許多研究用IAA與ABA質量分數比值衡量插穗的生根情況。然而，在扦插生根過程中，IAA與ZR質量分數比值也有著重要的調節功能，吲哚乙酸和玉米素核苷的協同作用，促進了愈傷組織的形成，不定根的產生、伸長、生長[22]。上述研究表明，插穗的內源激素通過動態聯合來調控不定根的發生過程，生長調節劑則通過調節內源激素的質量分數來間接影響不定根形成和發育[23-24]。

研究通過對比分析2種不同處理的插穗在扦插生根過程中生理機理的動態變化，證明了營養物質質量分數、內源激素質量分數、氧化酶活性與米槁的扦插生根有關，且GGR-6加速了這些物質的代謝進程，促進了米槁的扦插生根。但米槁扦插生根的機制較為復雜，需要進一步對其生根機制進行深入解析。