藍(lán)莓及其提取物中花青素檢測(cè)方法的研究

陳子凡，董 瑩，何思東，劉 康，吳麗娟，黃 浩

1.河源市食品檢驗(yàn)所 (河源 517000) 2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心 (廣州 510700) 3.河源市工業(yè)和信息化局 (河源 517000) 4.河源海關(guān) (河源 517000)

藍(lán)莓含有兒茶素、綠原酸、花青素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，具有抗癌、保護(hù)心血管、保護(hù)肝臟、預(yù)防近視等作用[2-4]。從2003年起至今，以藍(lán)莓為原輔料登記保健食品有98種，配方中的功效物質(zhì)均以花青素為主，隨著藍(lán)莓花青素的保健功效被群眾所日漸認(rèn)可，藍(lán)莓產(chǎn)品的市場(chǎng)會(huì)越來(lái)越廣闊[5-6]。本文通過(guò)查找和收集國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)藍(lán)莓花青素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和現(xiàn)狀進(jìn)行分析，為藍(lán)莓中花青素檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和制標(biāo)提供參考。

1 藍(lán)莓花青素成分概述

花青素，屬于水溶性植物色素，基本結(jié)構(gòu)為黃鎓鹽陽(yáng)離子結(jié)合物。藍(lán)莓主要含有矢車(chē)菊素、飛燕草素、錦葵素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥素6種[7]，但由于結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，花青素在藍(lán)莓中以糖苷類(lèi)物質(zhì)存在[8]，這些糖苷類(lèi)物質(zhì)通常由花青素和1個(gè)或多個(gè)葡萄糖、蕓香糖等糖結(jié)合而成[9]。

2 檢測(cè)技術(shù)的研究

藍(lán)莓花青素檢測(cè)方法主要有pH值示差法、分光法、色譜法、質(zhì)譜法。其中pH值示差法、分光法只能檢測(cè)花青素總含量，色譜法可測(cè)定花青素類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量，而質(zhì)譜法則可以檢測(cè)到花青素糖苷的種類(lèi)和含量。本文也列舉兩種類(lèi)似藍(lán)莓產(chǎn)品檢測(cè)花青素的質(zhì)譜方法作為參考。

2.1 pH值示差法

pH值示差法采用光度計(jì)于510 nm和710 nm處檢測(cè)吸光值，計(jì)算可得花青素的總含量，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

張榮菲等[10]通過(guò)正交試驗(yàn)，分析了60%乙醇中鹽酸含量、超聲提取時(shí)間、料液比和超聲提取水浴溫度，發(fā)現(xiàn)60%的乙醇-0.2%鹽酸溶液對(duì)藍(lán)莓果實(shí)中花青素提取效果影響最大，在該提取條件下使用pH值示差法檢測(cè)藍(lán)莓果實(shí)中的花青素，測(cè)得藍(lán)莓果實(shí)的花青素含量為1.91 mg/g。葉紅玲等[11]通過(guò)正交試驗(yàn)，確定提取藍(lán)莓果渣中花青素的最佳工藝條件是選用pH值2.5的70%乙醇水溶液、超聲波功率200 W下每提取2 s停4 s的間歇，料液比(g/mL)1∶30、30 ℃超聲20 min，最終測(cè)得果渣的花青素含量為9.99 mg/g。張星[12]等采用1 mL藍(lán)莓試供液分別與9 mL pH 1.0的KCl緩沖液和9 mL pH 4.5的NaAc緩沖液混合，靜置15 min后檢測(cè)510 nm和700 nm下的吸光度，并以蒸餾水為空白，測(cè)得藍(lán)莓提取液中花青素含量為160.30 mg/100 g。

2.2 分光法

分光法是在520～540 nm波長(zhǎng)之間進(jìn)行掃描，獲得特征峰，利用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品確定花青素的百分比含量。T/CCCMHPIE 1.25-2016中[13]，稱(chēng)取15～20 mg越橘提取物樣品用60 mL 2%鹽酸-甲醇溶液在80 ℃水浴中回流水解0.5 h，然后過(guò)濾，以2%鹽酸-甲醇作空白，在540 nm吸收波長(zhǎng)下對(duì)花青素進(jìn)行檢測(cè)。該方法測(cè)得花青素含量以飛燕草素計(jì)，數(shù)值以百分比含量%表示。

曾榮華等[14]參照T/CCCMHPIE 1.25—2016，稱(chēng)取樣品50 mg，加入30 mL 2%鹽酸甲醇溶液進(jìn)行超聲提取，冷卻后用2%鹽酸甲醇溶液定容，稀釋后以2%鹽酸甲醇溶液作為空白，在540 nm處測(cè)量吸光度，測(cè)得藍(lán)莓樣液的花青素含量為25.4%。

2.3 色譜法(LC)

LC法是在加溫下將花青素苷類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成花青素，使用紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)可測(cè)得花青素的種類(lèi)和含量。

NY/T 2640—2014標(biāo)準(zhǔn)，取勻漿后的藍(lán)莓樣品1～10 g，用25%鹽酸-乙醇水溶液定容至50 mL，超聲提取30 min后于沸水浴中水解1 h，靜置后取上清液過(guò)0.45 μm水相濾膜，使用UV或DAD檢測(cè)器檢測(cè)，該方法的檢出限在0.15～1.50 mg/kg之間[15]。

T/CCCMHPIE 1.25—2016中[13]，稱(chēng)取125 mg樣品加入25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇溶液定容，移取溶液用10%磷酸水溶液定容，過(guò)0.45 μm濾膜后在高效液相色譜上用外標(biāo)法定量。

陳海龍等[16]考慮到藍(lán)莓花青素常用的萃取液為有毒的甲醇和乙醇，研究使用食用有機(jī)酸作為提取溶劑。稱(chēng)取2 g打漿藍(lán)莓，加入30%檸檬酸溶液，超聲30 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)膜，利用高效液相色譜法檢測(cè)，該方法的精密度RSD為1.36%，最低檢出限為0.06 mg/kg，加標(biāo)回收率為98.28%。

王歡等[17]通過(guò)對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、水解溫度、水解時(shí)間的研究，采用了稱(chēng)取1～5 g樣品，用鹽酸-乙醇-水(1∶2∶1)提取液定容至25 mL，超聲提取30 min，然后在120 ℃烘箱中水解60 min，再統(tǒng)一采用HPLC在525 nm檢測(cè)波長(zhǎng)處對(duì)6種花青素進(jìn)行檢測(cè)。該方法的花青素回收率在80.50%～108.80%。

王馨悅[18]將樣品粉碎勻漿后，以1∶10的料液比加入52%乙醇，以469 W微波提取4 min，提取液于3 500 r/min離心5 min后取上清液減壓濃縮，冷凍干燥后制成浸膏備用。檢測(cè)時(shí)，用純凈水復(fù)溶稀釋后過(guò)0.45 μm水相濾膜上機(jī)測(cè)試。該方法的共有峰面積RSD值為1.12%～2.62%，保留時(shí)間RSD值為0.14%～0.31%。

Matthew Hynes[19]等使用30 mL的乙腈-0.3%磷酸水溶液(80∶20)作為萃取液，將0.3 g藍(lán)莓均質(zhì)1.5 min，最后以2 500 r/min離心10 min，取2 mL上清液和200 μL濃鹽酸混合，放入具有自封隔膜的玻璃瓶中，渦旋后放入150 ℃的烘箱中水解30 min。30 min后，取出玻璃瓶放入0℃的冰箱中10 min，以停止水解。從冰箱取出樣品后，恢復(fù)至室溫，立即過(guò)0.45 μm濾膜，上機(jī)分析。結(jié)果顯示曲線R2值在0.988～0.992之間，6種花青素能在2分鐘能完全出峰。

Pranathi[20]等稱(chēng)取0.125 g樣品，采用了1 mL的2%甲酸-甲醇溶液作為提取液，旋渦攪拌溶解，再加入4 mL 10%磷酸溶液，分析前，使用0.2 μm醋酸纖維素濾膜過(guò)濾樣品。結(jié)果顯示曲線R2值在0.999 1～0.999 8之間，檢測(cè)低限在0.10～1.56 μg/mL之間。

2.4 質(zhì)譜法(MS)

采用MS法無(wú)需將花青素糖苷水解和提純等前處理，降低了花青素的損失，可以測(cè)得花青素苷類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)及含量。

韓雪[21]等稱(chēng)取2 g藍(lán)莓果泥，按1∶15(g/mL)加入50%甲醇水，在80 ℃下回流提取1 h，將提取液于8 000 r/min下離心10 min，上清液用0.25 μm濾膜過(guò)濾，使用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOFMS)分析，在6種藍(lán)莓果實(shí)中鑒定出13種的花青素糖苷。

島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司-分析中心[22]采用稱(chēng)取10 g樣品用20 mL 80%甲醇溶液超聲提取15 min、9 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取2次，合并定容至50 mL，過(guò)0.22 μm膜后使用三重四極桿質(zhì)譜儀(QQQ)檢測(cè)花青素苷含量，該方法在0.1～2.0 mg/kg范圍內(nèi)建立校準(zhǔn)曲線，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.69%～5.13%之間，花青素苷的最低檢出限量在0.000 3～0.028 9 μg/mL。

張協(xié)光[23]等稱(chēng)取1 g粉碎后的樣品用5%甲酸-甲醇溶液定容，超聲提取30 min，再次定容后離心，過(guò)0.22 μm濾膜后上線性離子阱質(zhì)譜儀(LITMS)檢測(cè)，建立了可以同時(shí)6種花青素苷和6種花青素的方法，結(jié)果表明在0.042 4～19.9 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回收率為61.9%～112.7%，方法的檢出限在1.73～8.10 ng/mL。

2.5 其它方法

本次研究也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似藍(lán)莓的產(chǎn)品采用了一些可供參考的質(zhì)譜方法，這些方法可以快速檢測(cè)花青素苷類(lèi)物質(zhì)的含量，前處理更為簡(jiǎn)便快捷。

夏碧琪[24]等采用親水作用色譜(HILIC)串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)葡萄酒中的4種花青素，葡萄酒試供品用甲醇稀釋1 000倍后，無(wú)需其他前處理，過(guò)0.22 μm濾膜后，上機(jī)分析。該方法的線性范圍在1.0～50.0 ng/mL間，R值高于0.999 2，方法定量限為0.05～1.00 ng/mL。

王海敬[25]等采用甲酸-甲醇(1∶9)溶液為溶劑，加入內(nèi)標(biāo)物后進(jìn)行液液萃取，在4 ℃條件下提取12 h后，4 000 r/min離心取上清液上機(jī)，使用四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(QTOF)對(duì)番茄提取物進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)12種花青素，在線性范圍在1～1 000 μg/mL，定量限<1 μg/mL。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，pH值示差法和分光法，主要適用于花青素的總量檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于藍(lán)莓和藍(lán)莓產(chǎn)品的質(zhì)量鑒別、藍(lán)莓花青素含量的快速檢測(cè)。液相色譜法可以對(duì)藍(lán)莓的花青素種類(lèi)進(jìn)行定性和定量，有助于分析藍(lán)莓產(chǎn)品在花青素的分離提純時(shí)效果各種花青素在抗氧化效果方面的所起的作用和原理。質(zhì)譜儀法則直接檢測(cè)藍(lán)莓中的花青素的糖苷物質(zhì)。為選育藍(lán)莓品種提供參考，揭示花青素苷在藥品中構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制，以及花青素提取制備過(guò)程對(duì)天然色素結(jié)構(gòu)特征和功能活性的影響。隨著花青素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，建立藍(lán)莓及其提取物中花青素和花青素苷的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)提高藍(lán)莓產(chǎn)品質(zhì)量、保障消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)花青素產(chǎn)品質(zhì)量、提高食品監(jiān)管部門(mén)的檢測(cè)能力都有重要意義。