QuEChERS結合LC-MS/MS法在糧谷有機污染物檢測中的研究進展

蔣林惠，周易枚，陳 煜，袁琛凱，陳 彬

南通市食品藥品監督檢驗中心 (南通 226000)

農藥殘留和真菌毒素是可能污染糧谷的兩類有害物質。近年來糧食衛生檢查、食品監督抽查、食品安全風險監測等項目中，農藥殘留和真菌毒素已經成為重點監測對象。但由于農藥殘留和真菌毒素的品種極多，使檢驗工作量嚴重增加，尤其對大批量樣品檢查，檢驗效率明顯降低。故而開發高通量的多重污染檢測技術變得十分重要。

使用化學農藥，雖在控制農作物病蟲害發生以及保障糧食、經濟作物持續穩產豐收等方面，做出了突出貢獻[1]，但農作物可能由此受到嚴重污染，再加上工業三廢對水體土壤的污染，從而使得對糧谷的污染殘留監控變得尤為重要。而糧谷的儲藏加工過程中，由于空氣潮濕或儲藏不善，易遭受各種霉菌的侵害，霉菌的生長繁殖會產生多種有毒代謝產物，進而造成各種各樣真菌毒素的污染[2]。據不完全統計，全世界每年大約有25%的農產品被真菌毒素污染，約有2%的農作物因污染嚴重而失去經濟和營養價值，造成的損失高達數百億美元。中國作為糧食作物的主要產國之一，真菌毒素污染也造成了嚴重的經濟損失[3]。

糧谷中農藥殘留物主要采用色譜法，包括氣相色譜法、高效液相色譜法、氣質聯用法及液質聯用等技術，往往需要較為復雜的樣品提取和凈化等前處理過程。真菌毒素的檢測則是大多數先采用免疫親和層析提取、凈化后，再采用高效液相色譜法紫外、熒光檢測或質譜檢測[4]。這些檢測方案所需的時間成本和試劑成本較高，操作繁瑣。隨著檢驗檢測技術的發展，多種快速前處理方案的發布幫助有機污染物的檢測往便捷、高效的方向發展，QuEChERS快速樣品前處理技術(QuEChERS：Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是近年來發展較快、應用較多的技術之一。先進的檢測技術不僅能提高工作效率，節約資源，也是最終能為食品安全保駕護航[5]。

本文介紹QuEChERS結合液質聯用法近年來在糧谷有機污染物檢測中的應用，對其在實際應用過程中發現的問題進行了分析歸類，提出進行方法優化的思路，并展望其在糧谷有機污染物檢測中的應用和發展。

1 QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法在農藥殘留檢測中的應用

糧食作物生長過程中易遭受各種病害、蟲害和草害，為提高農作物產量，保證糧食生產安全，需要在不同的生長階段噴施農藥。但若農藥使用不當則會導致成品糧中農藥殘留過多，危害糧谷的食用安全。為快速了解糧谷中農藥殘留的實際情況，開發快速、準確的農藥殘留提取、凈化與檢測技術具有重要意義。目前，QuEChERS法已在農藥多殘留的檢測中得到了廣泛應用[6]。近年來，新儀器新技術的協同發展，使得QuEChERS法提取食品中農藥殘留的回收率不斷提高，同時提取的農藥殘留品種不斷增加，檢測限和定量限也逐漸降低。

陳溪[7]研究了大米205種農殘的快速提取，LC-Q-TRAP/MS測定方案。實驗取大米粉5 g，加10 mL水[8]，15 mL乙腈(含0.1%乙酸)，6 g MgSO4、1.5 g NaCl，上清液8 mL，1200 mg無水硫酸鎂，400 mg C18和400 mg PSA吸附劑，上清液過0.2 μm濾膜，LC-Q-TRAP/MS測定。205種農藥在添加水平為10 μg/kg時的平均回收率范圍為62.4%～127.1%，相對標準偏差(RSD)范圍1.9%～20.0%；添加水平為50 μg/kg時，平均回收率范圍為65.9%～120.3%，RSD范圍1.0%～18.4%。檢測大米中205種農藥的定量限均低于10 μg/kg，其中176種農藥的定量限為0.5 μg/kg，3種農藥的定量限為5 μg/kg，11種農藥的定量限為2.5 μg/kg，2種農藥的定量限為1.25 μg/kg，13種農藥的定量限為10.0 μg/kg，滿足我國、韓國、日本、歐盟等國家大米中農藥最大殘留限量(MRLs)的要求。

張利明等[9]進行了QuEChERS-LC-MS/MS實驗，針對稻谷生產中使用的農藥種類，大米樣品5 g大米經10 mL乙腈提取，加3 g氯化鈉，氮吹濃縮至2 mL，過濾膜，利用LC-MS/MS的多反應監測模式進行測定。結果表明：目標化合物線性關系良好，R2>0.996，在5、10、50、200 μg/kg 4個添加水平下，加標回收率為80.1%～109.9%，相對標準偏差為1.1%～13.5%。盧蘭香等[10]稱取適量試樣(黃瓜10 g、大米5 g、茶葉2 g)，加入10 mL水(大米和茶葉加水，黃瓜不加水)，渦旋混勻，加乙腈20 mL，加入醋酸鈉提取鹽，取上層提取液到15 mL PSA/C18凈化管中。取上清液10 mL，45 ℃氮吹濃縮至近干。用1 mL乙腈-0.1%磷酸水(1∶1，v/v)復溶，經0.22 μm有機相微孔濾膜過濾后上機測定。該方法中吡蟲啉在0.05～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好(R2≥0.999)，平均回收率在88.3%～109.1%之間，相對標準偏差不大于3.5%。

上述研究發現，進行糧谷中農藥殘留檢測時，多采用含有有機酸的乙腈溶液進行初次提取，再加入鹽析劑(多為硫酸鎂、氯化鈉或醋酸鈉)以期提高萃取效率，凈化試劑主要為單一組分C18、PSA、無水硫酸鎂或其多組分混合物。色譜柱選擇質譜專用C18柱即可，目標物進行LC-MS/MS多反應監測方式掃描定量[11-12]。該類研究方案均能獲得較為滿意的檢出限、回收率、相對標準偏差，其指定濃度范圍的線性關系良好。本文提及的研究對于提取液、鹽析劑、凈化劑各持己見，但這其中有幾處關鍵點需要注意，比如提取液的比例(乙腈、水、有機酸)、鹽析劑及凈化劑的品種及比例選擇。

2 QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法在真菌毒素檢測中的應用

糧谷類是受真菌毒素污染最嚴重的食品原料。近年來，由于氣候、耕作制度和栽培措施的顯著變化，導致真菌毒素對農產品的污染愈發嚴重。為了應對真菌毒素污染問題，許多國家和地區制定了糧食及其制品中真菌毒素的限量標準。同時，國內外研究者也對食品中真菌毒素的檢測方法進行了深入的研究，研究目的主要集中在提高樣品通量、縮短檢測時間、降低檢測限和提高準確性等[13-14]。

與農藥殘留相比，QuEChERS法在真菌毒素檢測中的應用相對較少，這是由于受真菌毒素污染最嚴重的食品主要是谷物和豆類，而谷物和豆類與果蔬的基本組分差異較大。谷物和豆類中水分含量較低，同時糖類、蛋白質和脂類的含量遠高于果蔬。此外，真菌毒素與谷物、豆類等物料組分的結合形式和果蔬中農藥殘留也有所不同。近年來，許多學者根據谷物和豆類的特性開發了許多基于QuEChERS法的真菌毒素檢測方法。

陳慧菲等[15]經過研究用改良的QuEChERS方法進行提取，用超高效液相色譜串聯質譜儀進行測定谷物中的8種真菌毒素。5 g樣品，提取液16 mL 1%的乙酸乙腈，鹽析劑6 g MgSO4、1.5 g NaCl，1 mL甲醇-乙酸銨溶液(1∶1，v/v)復溶，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。8種毒素的線性相關系數(R2)均不小于0.998，檢出限0.3～1.0 μg/kg，加標回收率76.5%～113.4%，相對標準偏差為0.78%～5.03%。姜濤等[16]建立了玉米中共17種真菌毒素的測定方法，5 g樣品，提取液25 mL含有1%甲酸的乙腈水(80∶20，v/v)，鹽析劑3 g NaCl，上清液濃縮至1 mL，0.1 g C18凈化，超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。線性相關系數(R2)均不小于0.994，檢出限為0.1～20.0 μg/kg，加標回收率為70.76%～115.14%，相對標準偏差為2.21%～11.34%。肖全偉等[17]實現了小麥中8種真菌毒素的同時測定。2 g樣品，8 mL 0.3%甲酸水溶液，10 mL乙腈提取，鹽析劑1.5 g MgSO4、0.5 g NaCl，上清液2 mL，150 mg無水硫酸鎂，150 mg C18和20 mg PSA吸附劑，提取液濃縮后20%乙腈水溶液溶解，液質聯用儀測定。8種真菌毒素在小麥中線性良好，相關系數(r)均大于0.99，方法檢出限0.10～1.0 μg/kg，樣品平均加標回收率85.1%～95.4%，相對標準偏差3.8%～8.5%。

王麗娟等[18]進行糧谷中16種真菌毒素測定研究，5 g樣品經20 mL乙腈-水-乙酸(84∶15∶1，v/v)溶液超聲提取，鹽析劑4 g無水MgSO4、1 g NaCl，提取液采用120 mg C18、600 mg MgSO4凈化，凈化液過0.22 μm微孔濾膜，用HPLC-MS/MS分析檢測，結果能滿足日常檢測需求。Koesukwiwat等[19]采用研究利用QuEChERS法提取大米中的14種真菌毒素，所用提取溶劑為水-乙腈(10∶10，v/v)混合溶劑，鹽析劑4 g MgSO4和1 g NaCl，8 mL上清液，加入1.2 g MgSO4、0.25 g C18、0.25 g中性氧化鋁(Al-N)和0.4 g PSA凈化，結果滿意度高。

總結上述學者對于谷物中真菌毒素的檢測方案：提取液中水的比例是提取效率的關鍵點，選擇水、乙腈、有機酸三者的比例對于提高提取率十分重要；鹽析劑的選擇與農藥殘留提取相似；凈化試劑則更為多樣化，C18、PSA、中性氧化鋁、MgSO4；濃縮后復溶試劑的選擇十分重要(有機相種類、有機相比例、銨鹽)，建議選擇與初始流動相相一致的復溶試劑。

3 QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法在復合污染物檢測中的應用

總結現有的QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法應用于糧谷類產品的實例，其多局限于農藥殘留或真菌毒素單類藥物，使用QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法同時測定農獸藥殘留和真菌毒素的方法仍較少見。

趙健等[20]建立了同時測定大米10種真菌毒素和殺鼠劑的檢測方法。大米樣品2.5 g，使用10 mL乙腈-水-甲酸(體積比80∶19∶1)作為提取溶液，80 mg PSA凈化，凈化溶液經濃縮、復溶后，采用液質聯用儀測定，外標法定量。結果表明：10種藥物的線性范圍為2～100 μg/L，線性關系良好(R2>0.99)，各藥物的平均加標回收率在75.2%～110.0%，相對標準偏差在1.4%～10.7%，方法定量限在0.5～2.5 μg/kg，適用于大米中10種殺鼠劑和真菌毒素殘留的同時快速定性定量分析。高璐斐[4]進行了小麥種污染物的專項研究，實驗稱取5 g樣品，加入20 mL甲酸/水/乙腈(v/v/v，1∶14∶85)和少量的氯化鈉以及4 g硫酸鈉，提取上清液5 mL，裝入0.1 g C18吸附劑，取上清液3 mL濃縮，加入500 μL甲醇/水(v/v，3∶2)混合液溶解，過0.22 μm濾膜，液質聯用儀測定。采用本方法可以同時對14種小麥污染物進行定性定量測定，其線性方程相關系數R2均大于0.99；檢測低限均在現有限量范圍內；農藥殘留殘留回收率在87%～103%之間，真菌毒素回收率在82%～96%之間。

同時提取測定多類有機污染物，所需考慮的因素相應增加，農藥殘留類物質與真菌毒素類在有些性質方面相差較遠，如何選擇一個合適的提取體系變得較為困難。糧谷類的特殊性質對于凈化試劑也有特殊選擇性，需根據實際樣品進行篩選，凈化試劑多選擇單一品種，不再進行多成分組合。

4 結語

大量的研究發現進行糧谷中農藥真菌毒素殘留的高通量快速檢測技術研究，從前處理的快速提取技術到目標物的儀器確認，其思路一脈相承。QuEChERS技術講究快速、簡單、低了價、高效、安全，其主要通過提取液提取、鹽析劑萃取、凈化試劑再凈化三大步驟進行樣品中目標物的富集。

各項研究中，提取液、鹽析劑、凈化劑得選擇并不一致，有些研究甚至省略了凈化步驟。這些方法雖然在已有研究中獲得了較為滿意得效果，但作為一種通用方案并不完善。筆者期望能夠對已有得方法進行優化，建立一種適用于糧谷中多類別污染物的快速檢測技術。進行糧谷中農藥殘留及真菌毒素的檢測時，對以下幾個方面提出優化建議。

(1)提取液。需特別注意糧谷樣品蛋白質及糖類組分較高，提取和凈化過程中易交聯形成網絡結構，提取液中加入一定比例的水，能浸潤糧谷顆粒，增加有機溶劑對非水溶性基質的滲透性，提高目標物提取效果；有機相選擇乙腈，因乙腈易于鹽析、溶解農藥、真菌毒素的能力較強，且萃取物中脂類物質的雜質含量較低；少量的甲酸能調節pH，并有效提取對于酸度、極性較為敏感的真菌毒素，并降低對堿敏感的農藥或毒素的影響[21]。故而建議提取液選擇乙腈∶水∶甲酸的混合溶液。

(2)鹽析劑。MgSO4是促進液液分配的最佳選擇，且可以增大極性組分的回收率，但會引入極性組分雜志；添加NaCl可以調節極性、減少極性雜質的干擾，但也會導致液液分配效果變差。在實際應用將MgSO4和NaCl混合使用，以獲得最佳鹽析效果。鹽析劑選擇MgSO4∶NaCl質量比為4∶1。

(3)凈化試劑。C18對長鏈脂類物質、甾醇等非極性干擾物有良好的吸附效果。PSA能有效吸附糖類、脂肪酸、有機酸、脂類以及某些色素等，也易與酸性真菌毒素(OTA等)分子上羧基反應，影其回收率。凈化試劑建議選擇C18。

(4)復溶試劑。復溶試劑的選擇需兼顧目標物的溶解能力及溶劑效應。建議選擇初始流動相作為目標物的復溶試劑。

建立適用于糧谷中真菌毒素及農藥殘留的快速檢測方案，達到高效，準確，高通量的目標，除上述關鍵點，可能還有其它方面，需要通過更深入的探索來加以完善。