芒果組織培養研究進展

王素杰，李 鳳，員 楠，張漢堯

(西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室，云南 昆明 650224)

芒果(MangiferaindicaL.)是一種原產于印度的漆樹科(Anacardiaceae)杧果屬(Mangifera)常綠大喬木，又名望果、蜜望、莽果、抹猛果。廣泛分布于亞熱帶和熱帶地區，中國的芒果資源十分豐富，其產區主要集中在廣西、廣東、云南、福建、海南等省份。芒果肉質細膩、風味獨特，享有“熱帶水果之王”的美譽，與蘋果、香蕉、柑桔、葡萄齊名世界五大水果，是亞熱帶和熱帶地區的主要經濟作物之一。早在1982年，學者開始探索芒果組織培養的技術，美國學者Litz R.E.等[1]最先通過分離芒果的胚珠進行組織培養，獲得了體細胞胚。1989年，Dewald等[2]以Paeeis和James Saigon 2種多胚芒果的珠心組織為外植體，在改良的B5培養基中誘導獲得了體細胞胚，繼續培養得到了完整植株。1995年，Raghuvanshi等[3]報道了從Amrapali芒果的嫩葉中誘導出愈傷組織并成功得到完整植株。20世紀90年代以來，我國的許多學者也相繼開始了芒果組織培養的研究工作，目前該技術達到一定水平，在芒果愈傷組織的增殖，早期體細胞胚的發生等諸多領域建立了離體再生體系。本文對近年來芒果組織培養技術的研究概況及應用進展進行闡述，以期為芒果遺傳改良、種質資源保存和創新提供參考。

1 外植體的選擇

1.1 外植體的來源

由于植物的胚珠和珠心細胞是不含病毒的，所以在芒果組織培養中，大多利用芒果的胚珠和珠心做為外植體，同時對其它器官和組織也進行過再生研究[4]。黃鏡浩等[5]以扁桃芒未成熟的珠心組織為外植體，接種在改良的B5培養基上，培養35 d左右，長出少量的胚性愈傷組織；再經過90～120 d的成熟培養，發育成乳白色的成熟體胚，最終有3個體胚萌發成苗。最近也有學者利用芒果的其它組織和器官誘導成功的報道。肖潔凝[6]研究發現，以芒果樹的頂芽、花枝、葉柄、幼果和子葉節等外植體誘導不定芽時，只有子葉節能誘導出腋芽，在IBA培養基上繼續誘導可以生根。而吳永杰[7]以紫花芒和紅芒的子葉和胚珠作為外植體的研究中，發現子葉外植體的胚性培養物誘導率明顯高于胚珠外植體。王曉峰等[8]以離體胚軸為外植體，在DK和WPM培養基上可以正常成苗。因此，外植體的選擇應從植物的取材部位、消毒難易程度等諸多因素加以考慮。

1.2 外植體的消毒

外植體的消毒是組織培養中的重要環節。對于消毒劑的選擇既要考慮殺菌效果，又要考慮清洗難度，還要盡可能的使外植體組織保持活力。常見的消毒劑有70%～75%酒精、2%次氯酸鈉溶液、0.1%～1%的氯化汞溶液等。采用胚珠或珠心細胞作為外植體時，由于它們是無毒的，所以只需將芒果果實表面進行消毒即可。消毒過程如下：先用70%的乙醇浸泡10 min，再用滴加2～3滴吐溫-20的1%次氯酸鈉溶液處理20～30 min，然后用無菌雙蒸水清洗2～3遍，最后無菌取出胚珠或珠心細胞即可[9]。Raghuvanshi等[3]采用Amrapali芒果的嫩葉做為外植體，帶回實驗室后，先用自來水沖洗30 min，然后用1%吐溫-80浸泡5 min，用無菌水沖洗數次，之后用70%酒精處理30 s，0.05%氯化汞處理2 min，最后用雙蒸水至少沖洗5次；消毒處理后再用不同植物生長調節劑和培養基培養，存活率最高達36%。不同材料對消毒劑的敏感程度不同，通常葉片消毒繁瑣。因此，在消毒步驟中，應根據外植體的采集部位、大小等因素選擇合適的消毒劑和消毒時間。

2 培養基和植物生長調節劑的選擇

2.1 培養基

不同的外植體材料所需營養不同，所以選擇合適的培養基配方顯得尤為重要。一般而言，幼胚做為外植體時，常用改良的B5培養基[9-14]，也有使用WPM、MS等其它培養基的報道[1，15-16]。不同的外植體在不同種類的培養基上生長狀態不同。王曉峰等[8]比較了以芒果離體胚軸為外植體，在DK、MS、1/2 MS、WPM 4種基本培養基中的成苗情況，結果顯示僅在DK和WPM培養基中能正常成苗。Raghuvanshi等[3]在對芒果的嫩葉進行培養時，先將嫩葉置于液體MS培養基上預培養，以減輕酚類物質對外植體的抑制效果；然后再轉接到固體MS培養基上，可以長成完整植株。此外，利用芒果的珠心作為外植體培養時，研究人員先用1/2 MS培養基進行預培養，然后再轉入改良的B5培養基進行培養，也獲得了再生植株[17]。

2.2 植物生長調節劑

在植物組織培養過程中，不同種類和濃度的植物生長調節劑以及配比，都會影響植物組織和器官的正常生長。常見的植物生長調節劑有2，4-D、NAA、6-BA等，2，4-D有利于植物愈傷組織的生長，而后兩者有利于植物器官的分化。有研究表明，2，4-D 0.5 mg·L-1時，有利于芒果愈傷組織的形成[17]。在增殖培養過程中，細胞分裂素KT最適質量濃度為5 mg·L-1，高濃度的2，4-D不利于愈傷組織的增殖分化，因此應降低其濃度或去除[18]。張越陽[19]研究表明，將培養基中2，4-D濃度減半可以使愈傷組織增殖情況變好。

3 培養條件

3.1 光照

光照是植物生長和發育的必要條件之一，適宜的光照可以延長愈傷組織的保存時間。研究表明，愈傷組織培養所需的最適光照強度為1000 Lx，16 h·d-1；而再生植株幼苗則需要更強的光照，為1500～3500 Lx，16 h·d-1；光照強度的增強其成活率和生長速度也隨之提高[1，9，20]。

3.2 pH值

培養基的酸堿度過高或過低都會引起植物組織生長不良，最終導致外植體死亡。一般認為，木本植物組織培養的最適pH為酸性。研究表明，適合芒果組培的pH值在5.7～5.8之間[20-21]。

3.3 碳源

蔗糖是植物組培中的重要碳源，同時可以調節植物細胞的滲透勢。芒果組培中，不同生長階段所需要的蔗糖濃度不同，質量濃度一般在20～60 g·L-1之間，芒果外植體誘導愈傷組織時所需的蔗糖質量濃度常規是60 g·L-1[1，14，20-22]。VLaxmi等[23]在研究芒果胚胎發生時發現，使用不同的蔗糖濃度，胚胎萌發情況不同，蔗糖質量濃度為60 g·L-1時，萌發比例可達28.3%，質量濃度為30 g·L-1時的萌發率最低。Xiao等[20]用Zi-Hua芒果為實驗材料培養再生植株時，蔗糖質量濃度用40 g·L-1同樣取得了不錯的效果。

4 芒果組織培養中存在的問題

4.1 污染

污染是指在組織培養過程中，培養材料或培養基上滋生細菌、真菌等微生物的一種現象。污染主要來自3個方面：一是由于外植體材料表面或內部所帶的病毒、類菌原體等微生物消毒不徹底，隨著材料帶入培養[24]；二是接種和培養環境不清潔，再加上接種工具消毒不徹底都會造成污染的問題；三是接種人員操作不規范，接種過程中大聲說話，手接觸培養容器邊緣等。因此，盡可能選擇在人工氣候箱或溫室培養的材料，選擇合適的消毒方法徹底消毒，嚴格按照規范進行操作以降低污染。農艷豐等[25]在芒果莖段的組織培養中，為了減少污染，先將芒果胚埋進消毒的沙床上進行催芽，待長出的苗高15 cm后，剪去莖段做為外植體，再進行消毒處理，這樣可顯著降低材料的污染率。

4.2 褐化

褐化是指在組織培養中外植體變成褐色從而死亡的現象，是組培過程中普遍存在的問題。研究表明，向培養基中添加吸附劑和抗氧化劑可以有效的控制褐化[26]。Raghuvanshi等[3]將消毒后的芒果幼葉接種到添加0.05% PVP的MS液體培養基中，放在搖床上震蕩培養并定時更換培養基，結果發現外植體褐化顯著減少，存活率提高到36%。黃鏡浩等[5]研究發現，繼代培養基中降低2，4-D濃度，同時添加Vc 50 mg·L-1，并與成熟培養基交替使用，可有效地降低褐化率。農艷豐等[25]探索不同防褐化措施的防治效果，結果表明添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的培養基中外植體褐化率最低，比添加AC或Vc的培養基效果要好。王曉峰等[8]在對芒果離體胚軸的培養試驗中發現，MS和1/2 MS液體培養基中誘導的胚軸褐化嚴重，最終導致死亡，而在DK和WPM液體培養中褐化不顯著，可以誘導成苗。

5 展望

植物組織培養技術可以縮短繁殖周期，在苗木快繁、花藥培養和培養脫毒苗等方面廣泛應用。組織培養在芒果繁育上有了一定的進展，但是在酚害控制和生根誘導領域的相關技術不夠成熟，應積極攻克芒果組織培養中存在的難題，不斷完善芒果組織培養體系，可望為芒果優良品種的保存和遺傳轉化提供技術支持。