中性粒細胞胞外誘捕網在呼吸道中的作用研究進展

王逸凡，代蓉，晏雪梅，李爽，李秀芳

(云南中醫藥大學藥理教研室，昆明 650500)

中性粒細胞是體內最豐富的白細胞，約占已發現人體循環血液中白細胞總量的60%[1]。中性粒細胞作為機體固有免疫防疫系統的重要組成部分，可在有毒顆粒蛋白和活性氧類的幫助下，吞噬和殺死與之相適應的細胞外病原體[2]，也可以通過分泌毒性蛋白和酶[髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)和防御素等]對抗細胞外微生物。此外，中性粒細胞可將活性氧類和一些促炎細胞因子釋放到細胞外微環境中，協助先天免疫反應[3]。因此，中性粒細胞構成了機體抵抗有害病原微生物入侵的一道防線。但近10年的研究發現，中性粒細胞是更為復雜的細胞，不僅具有先天免疫應答的效應功能，還具有通過與細胞因子直接相互作用或產生細胞因子來調節適應性免疫應答的能力[4-6]。2004年，Brinkmann等[7]首次發現了中性粒細胞對抗感染的另一種方式，即形成中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs是經刺激活化的中性粒細胞的細胞核內成分釋放至胞外而形成的一種網狀結構。研究發現，NETs在捕獲和滅活細菌、真菌和病毒方面起關鍵作用，但NETs過量聚集時，其對機體的保護作用易轉為損害作用[5]。現從NETs的結構、標志物、抗菌抗病毒及呼吸系統相關炎性疾病等方面進一步闡述NETs在呼吸道免疫過程中的雙向作用，為進一步探究NETs在上呼吸道感染向下呼吸道遷延進程中的關鍵作用提供新思路。

1 NETs的形成

與凋亡和壞死不同，NETs形成是一種新的中性粒細胞程序性死亡方式，是一個多步驟的死亡途徑，被稱為NETosis[7-8]。通過將中性粒細胞與抗死亡受體——Fas抗體孵育后誘導細胞凋亡，凋亡的中性粒細胞出現染色質縮合、細胞核破碎以及細胞質空泡化，而核膜和細胞器保持完整。壞死中性粒細胞的細胞核結構破壞，核小葉融合成均質團塊，但未分離成常染色質和異染色質。與凋亡和壞死的中性粒細胞相比，NETs最顯著的形態學差異是中性粒細胞核膜與胞質顆粒膜溶解，染色質與胞質內顆粒內容物的融合以及胞質細胞器的消失[9-10]。

目前已發現的NETs形成方式主要有自殺式NETosis和活性NETosis兩種。在自殺式NETosis中，中性粒細胞在受到促炎介質、過氧化物等刺激后2～4 h內活化，活化的成熟中性粒細胞呈扁平狀，并黏附于基底面，核染色體解聚，分葉結構消失，內、外核膜分離，顆粒膜、核膜消失，細胞核質、細胞胞質與顆粒成分融合，細胞變圓收縮直至胞膜破裂，細胞內容物呈網狀排出[10]。12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇是常用的自殺式NETosis誘導劑，可通過激活蛋白激酶C活化泛素連接酶-促分裂原活化的蛋白激酶-胞外信號調節激酶信號轉導通路，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，進而促發NETs釋放[11]。腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-8等促炎介質也能通過激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸信號誘導NETs產生[12]。此外，中性粒細胞在受到高遷移率族蛋白B1、脂多糖、革蘭陰性菌等刺激后，還可形成活性的NETosis，但并不在5～60 min內出現核膜或質膜破裂。活性NETosis受到刺激后，細胞核的小葉和多核形狀消失，細胞內外膜分離且囊泡出芽。細胞質與質膜融合后釋放到胞外與DNA結合[13-14]，此時中性粒細胞仍具有活性并能夠吞噬病原體[15]。活性NETosis依賴于Toll樣受體和補體蛋白的參與[16]。

研究表明，NETs的形成需依賴胞內NE和MPO。NE和MPO協同易位至細胞核內，降解組蛋白，使染色體去濃縮，促進組蛋白瓜氨酸化[9]。NE缺陷型小鼠不能形成NETs，表現出免疫缺陷。臨床研究發現，MPO活性缺乏患者不能生成NETs[17]，除NE和MPO外，細胞內肽酰基精氨酸脫亞胺酶4也被認為是NETs形成必不可少的因素。在NETs形成過程中，組蛋白高度纖維化介導染色質去致密化是其網狀結構形成的關鍵[18]，而肽酰基精氨酸脫亞胺酶4催化去除組蛋白H3精氨酸殘基上帶正電荷的-NH2基團，促進組蛋白修飾轉變成瓜氨酸化組蛋白，以削弱核小體中組蛋白和DNA之間的緊密靜電結合，隨后DNA骨架解螺旋，與抗菌蛋白顆粒結合，使細胞破裂和NETs釋放[9]。研究表明，NETs存在于多種脊椎動物(人、小鼠和半滑舌鰨魚)中[19-21]。

2 NETs的結構及標志物

通過電子掃描和共聚焦顯微鏡以及蛋白質組學分析對NETs的詳細解析顯示，NETs由薄的染色質纖維組成，其中包含約30種中性粒細胞蛋白，包括NE、殺菌/通透性增強蛋白、防御素、抗菌肽LL-37、蛋白酶3和粒細胞來源的組織蛋白酶G以及核組蛋白[22]。這些鑲嵌在DNA骨架上的蛋白增加了NETs局部殺菌濃度。NETs占據的體積可超過其來源細胞體積的10～15倍，且有多種形態，如絲狀結構、網狀結構、云狀結構[23]。NETs主要依靠其獨特的三維網狀結構捕獲病原體，主要由球狀結構及光滑延伸的脆弱纖維組成，這種獨特的結構為NETs發揮生物學作用提供了結構基礎。脫氧核糖核酸酶可降解網狀結構，故認為核DNA是NETs結構的支柱[24]。NETs的相關文獻指出，NE從細胞質轉移至細胞核，并通過降解組蛋白促使染色質去濃縮，而組蛋白的瓜氨酸化介導染色質去濃縮和NETs形成[18,25]。綜上所述，核DNA、NE以及組蛋白可作為NETs的特征標志物。

3 NETs在呼吸道中的雙向作用

中性粒細胞抵抗病原體的經典途徑主要通過趨化移行，從血管移至炎癥部位，吞噬病原變為吞噬體[26]，吞噬體與細胞內含有酸性水解酶和抗菌肽的特殊溶酶體相互作用，結合成吞噬溶酶體后被分解。而NETs的網狀結構可防止病原體的擴散，并維持抗菌物質在感染部位的聚集，更好地發揮清除和殺滅一些病原體及其毒力因子的作用[8]。NETs作為機體先天性免疫的重要環節，在抵抗御病原體侵襲方面起積極作用。當病原體入侵機體時，NETs能迅速形成并遷移到感染部位，捕獲并限制病原體，再通過高濃度的抗菌分子殺滅病原體，為機體提供有效的抗菌防御保障。此外，NETs還可能作為免疫效應和促炎因子的來源，促進組織損傷和自身免疫[27]，NETs的形成伴有大量胞內和核內自身抗原的暴露[28]，若NETs過度形成或未及時清除，其富含水解酶和DNA的粘連網狀結構附著于內皮，可引起內皮細胞凋亡，直接導致組織損傷，同時也可通過釋放抗菌肽LL-37、α干擾素等內源性危險信號，誘導自身免疫[29]。研究表明，體內過度形成NETs與許多呼吸系統疾病的病理過程有關[30]。

3.1NETs的防御功能

3.1.1抗菌作用 NETs在防御各種細菌方面起著至關重要的作用。除了捕獲和殺死細菌外，NETs活性成分也可以中和毒力因子。例如，NETs中大量的組蛋白通過增強細菌膜的通透性促進抗微生物肽形成膜孔，并阻礙細菌膜修復，從而使其具有抗菌特性[31-32]。此外，來自福氏志賀菌的侵襲性質粒抗原IpaB和IcsA(用于細胞-細胞擴散)可被NE降解[33-34]。現已證實，NETs可在體外有效降解細菌，包括許多與呼吸系統增殖和感染相關的細菌，如銅綠假單胞菌[35]、肺炎鏈球菌[36]、金黃色葡萄球菌[7]、嗜血桿菌[37]、組A鏈球菌[38]和大腸埃希菌[39]。在早期肺炎球菌肺炎小鼠肺泡中，也可觀察到NETs。更重要的是，NETs捕獲細菌的能力減弱了細菌從上呼吸道向下呼吸道的遷移，降低了細菌擴散到血液中的可能性[40]。由此可見，NETs有助于防御細菌性呼吸道感染。

3.1.2抗真菌作用 與NETs抗菌功能相比，目前對NETs在真菌感染中作用的認識尚淺。Urban等[41]報道稱，鈣衛蛋白作為NETs中的主要抗真菌成分，參與宿主防御白色念珠菌。鈣衛蛋白是中性粒細胞中最突出的胞質蛋白，約占所有胞質蛋白的50%，它通過螯合二價金屬離子抑制真菌的生長[42]。因此推測，鈣衛蛋白是防御真菌感染的有效成分。實驗證明，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶缺乏導致的慢性肉芽腫病中，中性粒細胞不能在肺中形成網狀結構以應對煙曲霉菌性肺炎[43]。故認為，NETs能增強宿主抗真菌能力。

3.1.3抗病毒作用 盡管細菌和真菌因粒徑較大不能穿過NETs而被捕獲，小病毒粒子理論上可以逃離誘捕網的包圍。但有研究指出，體外NETs捕獲病毒能夠降低宿主細胞的感染性，表明NETs有助于防御病毒性疾病的傳播[44]。如最典型的嬰幼兒嚴重下呼吸道感染的病原體——呼吸道合胞病毒可誘導Toll樣受體4依賴的NETs。NETs能夠捕獲呼吸道合胞病毒，從而減弱病毒顆粒與靶細胞的結合并防止感染[45]。除了簡單地捕獲病毒粒子外，NETs還具有直接的抗病毒活性[46]。從NETs中捕獲的病毒顆粒表現出較低的傳染性，NETs的這種直接抗病毒作用可能通過暴露出網中的顆粒蛋白(如MPO和防御素)而介導[47]。

3.2NETs對呼吸道的損傷作用 NETs在呼吸道的宿主防御中具有潛在的有益抗病性功能，當出現廣泛、失衡的中性粒細胞招募和激活時，中性粒細胞的保護作用很容易轉向損傷作用，并導致嚴重的呼吸道疾病。

3.2.1NETs與急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS) ALI是由多種誘因引起的以急性、進行性呼吸功能不全為特點的一種常見臨床危重癥，嚴重時表現為ARDS，即由各種非心源性內外致病因素(如嚴重感染、創傷、休克、吸入有害氣體、中毒)導致的急性、進行性、缺氧性呼吸功能不全或衰竭[48]。ALI/ARDS是由于直接或間接的過度肺部損傷和全身性炎癥反應所致，其中NETs發揮重要作用[49]。在ALI/ARDS急性期，激活的肺泡巨噬細胞分化為具有促炎作用的M1表型。M1型巨噬細胞釋放有毒物質(如一氧化氮、超氧化物和基質金屬蛋白)破壞組織，同時M1型巨噬細胞產生的腫瘤壞死因子-α和γ干擾素也會激活中性粒細胞，中性粒細胞在ARDS的急性炎癥反應過程中產生NETs[50]。

NETs上布滿了蛋白質復合物，這些蛋白質黏附在氣道上，加重了肺部損傷。Wan等[51]研究表明，網狀結構的形成可能導致體外肺上皮和內皮細胞的死亡，表明網狀結構對肺泡-毛細血管屏障有直接的毒性作用。在金黃色葡萄球菌誘導的ALI小鼠模型中，肺泡上皮細胞以及毛細血管中均存在網狀結構[52]。在機械性通氣引起的肺損傷以及輸血相關性的ALI動物模型中，網狀結構廣泛存在于肺微血管內[53-54]。因此，NETs對呼吸道和肺部的間接損傷可能在呼吸系統疾病中發揮作用。

3.2.2NETs與氣道阻塞 除直接損傷肺組織外，NETs的形成也會導致更多的間接并發癥。富含DNA和蛋白質的黏液所致氣道阻塞是許多慢性呼吸系統疾病[如囊性纖維化、哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)]的病理特征之一。研究證實，慢性呼吸系統疾病的黏液栓主要來源于中性粒細胞，以DNA、NE、MPO、Cith3蛋白復合物以及其他中性粒細胞蛋白復合體的方式沉積在NETs中，而NETs中的高水平DNA可以增強黏液的黏彈性，導致氣道阻塞和細菌繁殖[55-57]。當調節跨氣道上皮層的碳酸氫鹽和氯化物分泌平衡的囊性纖維化跨膜轉導調節因子的功能被破壞時，囊性纖維化患者的中性粒細胞凋亡延遲，這種細胞凋亡延遲使囊性纖維化中性粒細胞能更有效地形成NETs[58]。NETs的過度形成促使肺泡中的黏液變得黏稠，進而促使細菌(如流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌以及大量銅綠假單胞菌)的定植[59]。這種定植促進了NETs的中性粒細胞的浸潤，使痰液黏度增加，從而降低患者的呼吸能力。

CXC趨化因子受體2是一種G蛋白偶聯受體，它以高親和力結合CXC趨化因子配體，如CXC趨化因子配體8/白細胞介素-8。CXC趨化因子配體8/白細胞介素-8被認為是COPD氣道分泌物中吸引中性粒細胞的主要趨化因子[60]。此外，當COPD病情加重時，中性粒細胞上調并與CXC趨化因子及其互補受體結合，特別是CXC趨化因子受體1/2，從而在氣道黏膜中激活和募集[61]。同時CXC趨化因子受體2信號轉導參與調節COPD中性粒細胞的NETs的產生。CXC趨化因子受體2阻斷劑AZD5069能夠限制COPD患者離體血液和痰中NETs的形成[62]。另有研究表明，呼吸道合胞病毒通過磷脂酰肌醇-3-激酶和核因子κB信號轉導系統激活中性粒細胞，并抑制抗氧化酶的表達，引起氣道黏膜炎癥和細胞氧化損傷[63-64]。除上述機制外，融合蛋白F通過激活Toll樣受體4信號轉導聯級反應誘導活性氧類的產生及胞外信號調節激酶和p38促分裂原活化的蛋白激酶的磷酸化反應，釋放MPO和NE包裹的NETs[65]。NETs與脫落的上皮細胞和大量中性粒細胞共定位于密集的細胞栓塞中，從而引起氣道阻塞[45]。在融合蛋白F刺激下，DNA纖維上表達的NE和MPO通過破壞結締組織，降解內皮細胞基質硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，加重肺部呼吸道合胞病毒感染，導致感染后組織損傷[66]。由此可見，在慢性呼吸系統疾病中，NETs參與了一些特征性病理表現的形成，如蛋白堆積使分泌物變得厚重而黏稠，影響肺換氣功能，從而誘發或加重感染。

3.2.3NETs與結核病 結核病是由結核分枝桿菌引起的主要侵襲肺部的慢性傳染病，患病率和病死率較高[67]。通常進入肺部的病菌能夠被肺泡巨噬細胞吞噬并殺死，但結核分枝桿菌能夠在巨噬細胞內生存。在結核分枝桿菌感染早期，炎癥細胞被募集到肺部，并抑制結核分枝桿菌生長，此時結核分枝桿菌感染發展為潛伏性感染，肺實質肉芽腫的形成保證了芽孢桿菌與宿主防御的平衡。當機體免疫力降低時，機體的免疫反應不能抑制結核分枝桿菌生長，肉芽腫病變增加，潛伏性結核發展為活動性結核[68]。有證據表明，中性粒細胞是結核分枝桿菌感染后最早遷移至局部組織中的細胞，也是肺結核患者氣道中最豐富的白細胞[69]。在早期肉芽腫形成期，中性粒細胞被迅速募集到受感染的肺部，成為結核分枝桿菌的宿主[70]。當中性粒細胞受到兩種結核分枝桿菌基因型(H37Rv和M.canetti)的刺激時，中性粒細胞釋放嵌有NE和組蛋白的NETs[71]。NETs僅能捕獲結核分枝桿菌，但不能殺死結核分枝桿菌，這可能加重結核病的肺部損傷。另有研究發現，結核分枝桿菌分泌的早期分泌性抗原靶6 kDa蛋白誘導結核分枝桿菌從吞噬體逃逸到細胞質，并誘導NETs的形成[72]。中性粒細胞在活動性結核病患者肺肉芽腫中釋放高水平的鈣衛蛋白[73]，該蛋白是NETs的組成成分之一[41]。中性粒細胞釋放的鈣衛蛋白與NETs的結合不受限制。由此可見，結核分枝桿菌誘導的NETs加重了結核病患者的肺部損傷。

4 小 結

呼吸道感染作為常見的臨床疾病，其疾病進程與預后一直是臨床研究的焦點，但目前針對NETs在呼吸道中作用的研究較少。NETs可作為有益的抗微生物誘捕網起作用，但過度形成的NETs不僅未對疾病進程起到緩解作用，反而加重了組織損傷。此外，NETs參與抑制和殺滅黏膜上皮組織的病原微生物，但其相關作用及機制尚不明確，尤其是對呼吸道中鼻黏膜組織的研究非常有限，且上呼吸道NETs大量形成的原因仍需深入研究。因此，尋找NETs保護性和不良反應性之間的平衡點有助于未來探尋呼吸系統疾病防治的新療法。