脂肪干細胞在顱骨缺損修復中的研究進展*

賴文濤，張曉璐，趙志軍

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經外科；3.內蒙古自治區骨組織再生與損傷修復工程技術中心)

顱骨缺損是創傷、腫瘤、手術等引起的常見臨床問題。顱骨缺損導致顱內壓變化等臨床癥狀，因此修復顱骨缺損十分必要。目前臨床治療顱骨缺損的主要方法為自體骨、異體骨、鈦網等材料修補。如果缺損范圍較大，涉及自體骨采集過多，則會導致供體部位功能障礙；異體骨以及鈦網等材料存在免疫排斥的風險，目前缺乏一種較好的方法來治療大面積顱骨缺損。顱骨缺損直徑<3 cm可以自愈，不需要進行顱骨修復手術，一般>3 cm的缺損要進行顱骨修復手術。基于干細胞的骨再生和骨組織工程技術是顱骨修復和重建領域的一種尖端技術。脂肪干細胞(Adipose-derived stem cells，Adscs)是一類具有成骨分化潛能的間充質干細胞，具有取材容易、少量組織即可獲取大量標本，同時具有體外穩定增殖，適合自體移植等特點，因此在顱骨缺損修復中得到廣泛研究[1]。但由于缺少相應的血液系統供應，導致工程骨植入后骨形成不良[2]，這對大面積顱骨缺損的臨床重建提出巨大挑戰，因此血管生成對組織工程骨的構建具有重要意義。

1 脂肪干細胞的特點及表面標志

1.1脂肪干細胞的特點 2001年Zuk等[3]首次成功分離和培養出Adscs，其特性與骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchyml stem cell，Bmscs)相似。Adscs具有很強的增殖以及多向分化潛能，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和神經元細胞。Adscs還具有抗缺氧能力強、來源豐富、易于分離、免疫原性低等特點[2]。與骨髓間充質干細胞相比，可以反復獲取，并且具有血管分化的潛能[2]。從脂肪組織中獲取干細胞的數量至少是同等骨髓中可獲取數量的500倍[4]。據報道，Adscs的衰老時間比Bmscs晚，其增殖能力也更強[5]。相比于其他類型的干細胞，Adscs在某些生長因子和免疫調節因子的自分泌中也更為活躍[6]，例如Adscs表達的血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和白細胞介素-8(IL-8)mRNA水平高于其他間充質干細胞群體，包括Bmscs、真皮乳頭細胞和真皮鞘細胞。在缺氧條件下，Adscs分泌血管內皮生長因子(VEGF)的數量大約是正常氧條件下的5倍[7]。因此Adscs在缺氧條件下能促進血管內皮細胞生長，減少細胞凋亡。

1.2Adscs的表面標志 Adscs與其他干細胞一樣，存在多個表面標志。關于CD34在Adscs中的表達，現有文獻存在很大差異，人們普遍認為CD34不存在于細胞表面[8]，然而這一觀察主要是基于體外培養的間充質干細胞(MSCs)，而不是組織原有的MSCs。也有研究表明，CD34表達于新分離的Adscs中，并在幾次細胞傳代后消失[9]。與其他類型的MSCs相似，由于缺乏明確的細胞標記，Adscs仍然難以鑒別。Mizuno等人發現，Adscs相關標記物包括CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166，其在血管基質成分(SVF)細胞中最初表達較低，但會隨連續傳代的增加而顯著增加[10]。因此在考慮通過表面標志物來鑒定Adscs時也需要考慮傳代次數等因素。Adscs免疫表型表面標記中陽性表達的因子有CD90、CD44、CD29、CD105、CD13、CD73、CD166、CD10、CD49e和CD59，陰性表達的因子有CD31、CD34、CD45、CD14、CD11b、CD19、CD56和CD146。

2 脂肪組織的提取及分離

2.1脂肪組織的提取方法 脂肪組織主要存在于所有組織和器官的血管周圍區域，這些區域的Adscs含量較高，通過微創手術很容易獲得，使其成為基于細胞治療中的合適靶點。通過脂肪抽吸手術獲得大量脂肪組織，相比采集骨髓干細胞，其痛苦和創傷相對較小[11]。腹部淺表脂肪組織有較強的多能性和干性特征,標準的整塊切除和脂肪抽吸是兩種最常見用于獲取脂肪組織的手術方法。

2.2脂肪組織的分離 獲取脂肪組織是分離Adscs的第一步。第一次分離Adscs是通過適當洗滌，使用1型膠原酶消化，離心分離血管基質成分細胞(Stromal vascular fraction SVF)。SVF被認為是脂肪細胞祖細胞、Adscs以及其他細胞的來源，離心速度會影響細胞產量，1 200 g被認為是最佳離心速度。通過迭代培養，獲取貼壁生長的Adscs[12]。目前尚無統一的Adscs培養方法，在開始培養Adscs前，可以洗滌去除血液或其他殘留細胞[13]。

3 Adscs成骨分化的影響因素

在某些因素下，Adscs有可能分化為成骨細胞，為在短時間內解決骨相關疾病提供機會[14]。誘導Adscs成骨的因子包括地塞米松、抗壞血酸/抗壞血酸2-磷酸、膽囊鈣素和β-甘油磷酸酯，以及轉化生長因子-β(TGF-β)、維生素D3和骨形態發生蛋白(BMPs)等[15-16]。也有研究表明一種天然的黃酮類化合物——槲皮素，通過增強Osx、Runx2、BMP-2、Col-1、OPN和OCN等基因的作用，促進小鼠和人Adscs的成骨[17]。Adscs的成骨分化也受轉錄因子調控，如核心結合因子1α(CBF-1α)、Runt相關轉錄因子2(Runx2)、Osterix蛋白、同源盒蛋白Hox-B7(HOXB7)、Hoxa2、Hoxa9、核心結合因子β(Cbf-β)、溶血性增強子結合蛋白2β(Pebp2β)、Sox9、TNF-α、FOXC2、PPARγ、YAP、MyoD、BMP9、β-cat GATA4和GATA6[18]。其中轉化生長因子β(TGF-β)/骨形態發生蛋白(BMPs)、Notch信號通路、Wnt/β-catenin信號通路和成纖維細胞生長因子(FGF)等被認為是調節Adscs成骨分化潛能的主要信號通路[19]。

3.1地塞米松、β-甘油磷酸酯和血管內皮生長因子A(VEGF-A) 地塞米松通過激活FHL2/β-catenin通路，誘導RunX2和I型膠原α1(COL1A1)的過度表達；β-甘油磷酸酯則提供磷酸鹽，增加成骨基因的表達[20]。血管內皮生長因子A(VEGF-A)在骨再生中起著重要作用，因為它同時具有促進人Adscs血管生成和成骨的潛力，Behr等使用VEGF聯合Adscs局部治療小鼠顱骨缺損，相比對照組，使用VEGF處理的Adscs能改善嚴重顱骨缺損的愈合，并且這種修復伴隨著血管的生成而增強[21]。VEGF和BMP-2、4、6、9可通過表達成骨堿性磷酸酶基因促進成骨來進行聯合治療[22]。也有研究表明，缺氧除了促進血管生成外，還被證實可增強成骨潛能。缺氧條件下，IGFBP3的活化會抑制Adscs的成骨潛能，缺氧還會抑制堿性磷酸酶活性、核心結合因子α1(CBFA-1)和骨橋蛋白的表達，導致Adscs成骨潛能的負調控[23]。因此，在缺氧條件下Adscs的成骨分化潛能需要更多研究來證實。

3.2骨形態發生蛋白(BMPs) 骨形態發生蛋白(BMP)是一種細胞因子誘導劑，可用于誘導Adscs的成骨分化。BMP-2和BMP-7的臨床意義在澳大利亞、美國和歐洲等地區得到廣泛認可。BMP-2、BMP-6和BMP-14被認為是Adscs成骨分化的主要因素，BMP-7則促進軟骨形成和成骨[24]。也有人認為，BMP本身不足以指導MSCs分化為成骨譜系，因為它以相同的速度同時觸發脂肪生成和成骨。具體來說，BMP信號通路通過配體與異二聚體絲氨酸/蘇氨酸激酶BMP受體的結合而激活，從而觸發Smad依賴的信號通路(Smad1/5/8)和Smad無關的信號通路(JNK)的激活，最終介導脂肪生成和成骨[25]。Smad4與磷酸化轉錄因子Smad1、Smad5或Smad8的異二聚體激活Adscs成骨促進基因的表達。

3.3Wnt/β-catenin信號通路 Wnt家族由大量分泌性糖基蛋白組成，其廣泛參與胚胎發育、組織誘導分化和體軸分化。大多數Wnt蛋白被認為是由膜受體卷曲蛋白(Fz)和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)家族成員組成的細胞表面受體復合物的配體。在FzLRP5/6復合物的下游，典型的Wnt信號將β-catenin穩定和易位到細胞核，從而與T細胞因子/淋巴樣增強因子(TCF)/Lef轉錄因子結合。β-catenin-TCF/Lef復合物能激活多種Wnt反應基因的轉錄，包括參與細胞增殖、成骨細胞分化和成骨基因表達等[26]。德雷可夫斯基等發現Notch-1過度表達是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而不是BMPs信號來抑制成骨細胞發生，還有學者發現，酒精不僅抑制成熟的成骨細胞活性，還能抑制Wnt信號通路以及β-catenin蛋白的表達，表明酒精可通過刺激氧化應激抑制Wnt信號從而抑制骨形成[27]。有研究發現，CCN1/Cyr61的表達可能在Wnt3A誘導的間充質干細胞成骨分化中起重要作用，Wnt10b是人類和小鼠唯一與間充質祖細胞功能相關的Wnt配體，也是維持成人骨間充質干細胞活性所必須的信號[28]。還有一些研究表明，非典型Wnt信號也可能在成骨分化中發揮作用。例如涉及Ror2和RhoA的非經典Wnt5a信號以及N-cadherin介導的β-catenin信號是機械誘導成骨分化所必需的，而Wnt-4可能在改善骨再生和修復顱面缺損方面具有潛在的應用價值。Wnt5a可以誘導成骨分化，抑制PPAR-γ在Adscs中的表達，這一途徑激活β-catenin-T細胞因子/淋巴樣增強因子(TC F)/Lef轉錄因子(Lef)，進一步增強成骨[29]。

3.4Notch信號通路 典型的Notch信號當細胞表面表達的Delta/Serate/LAG-2(DSL)配體與在相鄰細胞表面表達的Notch受體(Notch-1、-2、-3和-4)結合時啟動。Notch信號在干細胞或是祖細胞的發育、再生以及控制其命運中起著重要作用。人們普遍認為，Notch系統較為保守的平衡了干細胞或祖細胞的增殖和分化。以往的研究表明，Notch信號對ST-2骨髓基質細胞、小鼠骨髓間充質祖細胞、成骨細胞M3T3-E1、間充質祖細胞Kusa、C2C12成肌細胞和COS-7細胞等多種細胞的成骨分化有正調控作用[30]。當腺病毒載體將Notch1胞內結構域(NICD)轉染到成骨細胞MC3T3E1細胞時，在長期培養中觀察到鈣化結節的形成明顯增加。在原代人骨髓間充質干細胞的培養中也觀察到類似的效果。當用含有人N1ICD或其配體Jagged1的腺病毒載體轉染到人骨髓間充質干細胞時，培養物表現出鈣化作用。然而，當顯性負性mastermind1蛋白與N1ICD或Jagged1共表達來抑制Notch信號時，細胞成骨分化的過程則會被部分延遲[31]。雖然Notch被證實在骨骼發育及修復中起著重要作用，但通過Notch信號誘導脂肪干細胞成骨分化方面的研究仍較少，這可能是未來開發新的骨組織再生及修復途徑之一。

3.5成纖維細胞生長因子(FGF) 由于沒有發現Adscs的特異性標記物，所以很難確定影響Adscs在體內自我更新的因素。FGF在體外Adscs培養過程中對Adscs的自我更新起著重要作用。Zaragosi等報道，Adscs倍增時間的延長與MSCs中FGF2表達的減少有關[32]。Adscs不表達FGF1，而表達FGFR1，這表明Adscs可能與FGF2更為親和。在20個傳代過程中，FGF2的加入增加了Adscs的增殖。與骨髓來源的MSCs相比，FGF2在Adscs中的表達更高，并通過增加初始增殖率促進Adscs的成脂和成骨分化[33]。

4 Adscs在顱骨缺損修復中的作用

目前骨組織工程在顱骨缺損修復中的一大難題是如何改善工程骨在體內的血運。體內Adscs處于低氧環境中，使其成為基于細胞治療的良好候選者，在植入后缺乏血液供應時，氧供應可能受到限制，導致工程骨植入后骨形成不良等問題。課題組之前的研究表明，低氧預適應/遠隔缺血預適應可通過促進海馬神經元再生，或分泌外泌體來提升神經細胞的低氧耐受能力。本研究結果表明，Adscs經歷低氧后成骨性基因蛋白質表達有增高趨勢，因此通過低氧預適應處理介導Adscs成骨也是一個具有前景的研究方向。Adscs能分泌血管生成細胞因子，如肝細胞生長因子和血管內皮生長因子，這些細胞因子被認為是Adscs血管生成特性[34]。通過移植Adscs產生的細胞因子和趨化因子，也可作為內源性干細胞和祖細胞向損傷部位集結的信號。因此，Adscs的存在不僅可以促進成骨分化，也可以促進血管生成。

雖然Adscs已被證明可以用于修復顱骨缺損，但許多國家尚未批準用于臨床，目前臨床使用案例較少。Thesleff等利用脂肪干細胞結合β-磷酸三鈣顆粒治療兩名顱骨缺損的患者，術后隨訪期間無臨床并發癥，并且復查頭顱CT也顯示令人滿意的骨化結果[35]。Sándor等用Adscs與Bmp2和β-磷酸三鈣顆粒結合治療1例因為腫瘤切除而導致下頜骨大面積缺損的患者，成功進行頜骨重建[36]。Adscs也可應用于微血管重建，kmesim等報道1例采用Adscs、Bmp2以及β-磷酸三鈣顆粒用于修復上頜骨缺損的病例，在手術重建4個月后，生成成熟的骨組織以及血管結構。Stefan等報道運用Adscs、自體纖維蛋白膠以及支架聯合治療1例顱腦重度損傷合并顱骨大面積缺損的7歲小孩，術后病情平穩，重建3個月后CT顯示新骨形成，顱骨連續性較為完整[37]。

5 總結

綜上所述，干細胞被定義為生物系統的組織單位，負責器官、組織的發育和再生，是先進組織工程和細胞治療中不可或缺的工具。成人干細胞可以自體取材并應用于自身。對于組織工程而言，成人干細胞可以播種在合成或自然衍生的支架上，并通過適當的支架組成、結構、力學性能和物理化學性質的組合，以及適當的細胞培養基、適當的機械或電磁刺激來分化為所需的表型。對于細胞治療而言，干細胞以自分泌方式產生的生物活性分子，特別是生長因子和免疫調節分子可以直接應用于受損組織。在成人干細胞中，脂肪組織干細胞被認為是最有前景的細胞類型，因為其Adscs分離簡單、相對安全。而脂肪組織被認為是Adscs最方便和最豐富的來源，具有易于獲取和較少的倫理復雜性，使Adscs成為再生治療方法中最合適的干細胞來源。同時Adscs在適宜的刺激因素下可以進行成骨分化，從而修復骨缺損，因此Adscs在治療顱骨包括顱面骨的缺損方面是可行的，并且這方面的臨床研究以及實驗正在不斷取得進展。但由于Adscs目前缺乏一個統一高效的培養方法，并且Adscs等其他干細胞所產生的生長因子、細胞因子、免疫抑制因子和其他生物活性分子可能對腫瘤轉移及生長存在一定支持作用，所以仍存在較大挑戰。隨著Adscs鑒定、分離、培養以及定向誘導其分化的方法不斷發展，可為未來臨床顱骨缺損修復提供效果非常好的治療途徑。