非洲豬瘟環(huán)境樣品采樣監(jiān)測技術(shù)及應(yīng)用

李曼 魏小麗 張丹 徐鳳文 何莎

（陜西省安康市畜牧獸醫(yī)中心 725000）

非洲豬瘟（ASF）自2018 年在我國發(fā)生以來，對我國養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了巨大的沖擊。雖然在廣大畜牧獸醫(yī)工作者的共同努力下，國內(nèi)生豬產(chǎn)能已在逐步恢復(fù)，但當(dāng)前非洲豬瘟防控已成為常態(tài)化工作，面對不斷變化的防控形勢，我們要進(jìn)一步提高認(rèn)識，升級防疫措施，做好內(nèi)外環(huán)境監(jiān)測，健全防控技術(shù)體系。目前規(guī)模化豬場的防控重點(diǎn)主要是通過控制飼料、車輛及人員往來等環(huán)境因素來降低病毒傳染概率。因此，環(huán)境監(jiān)測是非洲豬瘟防控動(dòng)物疫病的重要部分，是制定防控建設(shè)的重要依據(jù)。因此，對豬場周邊及內(nèi)部的環(huán)境進(jìn)行跟蹤了解，制定系統(tǒng)的規(guī)范化環(huán)境樣品采集、保存、運(yùn)輸程序，定期采集豬場的環(huán)境樣品，并進(jìn)行病原學(xué)檢測可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情隱患，有效切斷病原傳播途徑，同時(shí)為非洲豬瘟防控決策提供科學(xué)依據(jù)。

1 非洲豬瘟防控中環(huán)境樣品的監(jiān)測意義

非洲豬瘟防控是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，目前規(guī)模場的防控重點(diǎn)主要是通過建立完善的生物安全體系，按照要求規(guī)范操作來降低乃至杜絕病毒傳染的概率。而且病毒傳入僅從生產(chǎn)數(shù)據(jù)、臨床癥狀、病理解剖等外部信號無法得到準(zhǔn)確信息，必須借助實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的內(nèi)部信號來進(jìn)行確認(rèn)。目前部分大型養(yǎng)豬企業(yè)都建立了自己的ASFV 檢測實(shí)驗(yàn)室，可以開展豬群非洲豬瘟疫情排查。但調(diào)查發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)養(yǎng)殖企業(yè)僅是監(jiān)測豬只，對環(huán)境樣品的采集監(jiān)測很少，且缺少合理規(guī)范的采樣技術(shù)規(guī)程。而人員、車輛、物質(zhì)等環(huán)境因素是非洲豬瘟傳播的主要方式，是我們生物安全防控的重中之重。環(huán)境樣品監(jiān)測技術(shù)是衡量生物安全體系是否完善，執(zhí)行是否規(guī)范的重要手段，因此，環(huán)境取樣檢測在非洲豬瘟防控工作中發(fā)揮著重要的作用，規(guī)范有效的采樣對了解和評估環(huán)境質(zhì)量狀況至關(guān)重要。

2 環(huán)境樣品監(jiān)測技術(shù)在非洲豬瘟防控工作中的應(yīng)用

2.1 日常防控中的應(yīng)用

非洲豬瘟防控是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，目前規(guī)模場的防控重點(diǎn)主要是建立完善的生物安全體系，但我們不能拿豬場是否感染來判斷，需要環(huán)境取樣檢測來提供準(zhǔn)確的監(jiān)測預(yù)警。規(guī)模場可以針對生產(chǎn)區(qū)、生活區(qū)，尤其是容易接觸到豬場外部環(huán)境的區(qū)域，如豬場大門口、運(yùn)豬臺(tái)、人員進(jìn)出通道、車輛、物質(zhì)、水源等，定期采集環(huán)境樣本進(jìn)行熒光定量PCR 檢測。如若檢測結(jié)果為陰性，可根據(jù)養(yǎng)殖場規(guī)模及實(shí)際情況定期抽樣監(jiān)測。若檢測結(jié)果為陽性，要由里向外排查，分析病毒傳入具體原因，找出防控漏洞，根據(jù)情況及時(shí)整改，整改完成后再次采樣，直到檢測為陰性。

2.2 復(fù)養(yǎng)籌備工作中的應(yīng)用

經(jīng)過疫情的豬場要進(jìn)行復(fù)養(yǎng)必須要經(jīng)過徹底消毒，評價(jià)消毒效果需要進(jìn)行環(huán)境采樣監(jiān)測和引入哨兵豬。環(huán)境采樣監(jiān)測是復(fù)養(yǎng)籌備充分且必要的條件，引入哨兵豬則是充分非必要條件。引入哨兵豬僅能檢測舍內(nèi)凈化是否徹底，且必須保證足夠的活動(dòng)空間和飼養(yǎng)時(shí)間。因此，環(huán)境檢測對復(fù)養(yǎng)至關(guān)重要，不可替代，環(huán)境采樣檢測可以對豬場內(nèi)外環(huán)境進(jìn)行全面采樣，包括如圈舍、大門、走廊、用具、欄舍、出豬臺(tái)等處，通過全方位無死角的監(jiān)測，確保檢測的全面性和準(zhǔn)確性。復(fù)養(yǎng)前的環(huán)境樣品檢測可以在消毒工作完成后和豬只進(jìn)場前分兩次進(jìn)行，消毒工作完成后采集樣品檢測結(jié)果如有陽性，應(yīng)立即對檢測陽性場所重新清洗消毒，然后再次采樣檢測，直到檢測結(jié)果陰性視為消毒合格。豬只進(jìn)場前再次采集環(huán)境樣品檢測為陰性的可以恢復(fù)生產(chǎn)。

3 環(huán)境樣品采樣方法

非瘟防控是一個(gè)綜合、系統(tǒng)的生物安全體系，而日常監(jiān)測與監(jiān)控對生產(chǎn)具有關(guān)鍵性指導(dǎo)作用，監(jiān)測是否準(zhǔn)確是非瘟防控的重點(diǎn)環(huán)節(jié)，但大規(guī)模、高頻率的采樣監(jiān)測增加了豬群應(yīng)激和感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，非瘟防控尤其要把握好豬場進(jìn)出口及周邊環(huán)境的監(jiān)測，同時(shí)提升監(jiān)測技術(shù)的靈敏度和特異性。每個(gè)豬場需要根據(jù)自身疫病壓力和條件制定合理的監(jiān)測體系。

樣品采集區(qū)域：根據(jù)病毒傳入風(fēng)險(xiǎn)程度和常見漏洞區(qū)域分為3 類，一類區(qū)域?yàn)樨i舍內(nèi)部等不與外界接觸的生產(chǎn)區(qū)域（低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域），包括走（過道）、豬欄地面、豬欄欄桿、料槽、水槽、水嘴、風(fēng)機(jī)、水簾、墻壁、生產(chǎn)工具、走廊溫控器、糞溝、趕豬道/豬道等。二類區(qū)域?yàn)樨i舍外等與外界有部分接觸的區(qū)域（中風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域），包括趕豬道/人道、道路、場內(nèi)卡/鏟車、豬只處死點(diǎn)、場內(nèi)掩埋點(diǎn)、出豬臺(tái)、藥房倉庫、飼料塔、下料口紗布、飼料堆放點(diǎn)、水源、工作人員、辦公室、停車場、物品消毒間等。三類區(qū)域?yàn)閳鐾獾扰c外界直接接觸的區(qū)域（高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域），包括大門口路面、公路路面、消毒中心等。此外還要做好“四害”監(jiān)測，因老鼠、蒼蠅、蚊子、蟑螂等“四害”無孔不入，無法做到實(shí)時(shí)監(jiān)測，而理論上都有機(jī)械帶毒的可能，建議當(dāng)周邊有疫情時(shí)需加強(qiáng)除“四害”，尤其是老鼠，避免由發(fā)病豬場竄入。

采樣檢測周期：豬場應(yīng)根據(jù)周邊疫情壓力和場內(nèi)情況，制定合理監(jiān)測頻率，因場施策。根據(jù)豬場規(guī)模，與外界接觸即病毒傳入風(fēng)險(xiǎn)程度制定不同的采樣周期。高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域可根據(jù)外界人員、車輛、物資進(jìn)出等情況隨時(shí)進(jìn)行采樣監(jiān)測。中風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域可根據(jù)與外界接觸時(shí)間、頻次進(jìn)行采樣監(jiān)測，一般情況下可一周進(jìn)行一次采樣。低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域可根據(jù)豬群健康情況進(jìn)行采樣監(jiān)測，如豬有異常表現(xiàn)或出現(xiàn)死亡等情況時(shí)可隨時(shí)進(jìn)行檢測。豬群如無異常情況可在豬轉(zhuǎn)群或進(jìn)出豬時(shí)進(jìn)行采樣監(jiān)測，其他時(shí)間可兩周或一月進(jìn)行一次集中采樣監(jiān)測。

4 環(huán)境樣品采樣技術(shù)流程

由于環(huán)境樣品極強(qiáng)的空間性和時(shí)間性，要想正確了解和評估環(huán)境質(zhì)量狀況必須采集具有真實(shí)性和代表性的樣品。當(dāng)樣品不具備真實(shí)性和代表性時(shí)，任憑實(shí)驗(yàn)室分析工作再嚴(yán)密也無法彌補(bǔ)和改變樣品失真所致的嚴(yán)重影響即使測試質(zhì)量完全符合要求，而對于了解和評估環(huán)境質(zhì)量狀況也毫無意義，所以采樣是極其重要的一環(huán)。為此，必須切實(shí)重視采集樣品的質(zhì)量控制，使采集到的樣品符合計(jì)劃要求，是具有代表性和完整性的樣品。

4.1 豬場環(huán)境樣品的采集、編號與保存

豬場人員在進(jìn)行采樣時(shí)應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)措施（防護(hù)服、手套、鞋套、口罩等），準(zhǔn)備必要的采樣工具（滅菌棉簽、生理鹽水、1.5ml 離心管、封口袋、記號筆等），涉及采樣的所有用品確保在有效的使用期限內(nèi)。每個(gè)采集樣品前填寫采樣表，并將離心管做好標(biāo)記，編寫編號。樣品采集時(shí)要將棉簽用生理鹽水濕潤后采集，棉簽一支一采樣，采樣時(shí)不停的旋轉(zhuǎn)棉簽，保證接觸面積和采樣面積，采樣面積越大越容易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)病毒，從而最大程度的獲取病毒回收率。采集一個(gè)未經(jīng)采樣的棉簽樣品作為陰性對照。過程中注意避免液體濺出，每個(gè)樣品采集完畢后馬上蓋緊離心管蓋，采集樣品與其他采樣器具分別放置，以免造成交叉污染。

4.2 送檢樣品的包裝與運(yùn)輸

將采集的環(huán)境樣品采用封口膜封口，放入密封性完好的封口袋中保存。采樣單應(yīng)用鋼筆或簽字筆逐項(xiàng)填寫，樣品標(biāo)簽用記號筆填寫，采樣管用記號筆標(biāo)記。不同品種和種類的樣品不應(yīng)混樣，在樣品袋外標(biāo)記樣品名、樣品編號、采集日期等。采樣單和情況說明裝在塑料包裝袋中，并隨樣品送實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)樣品能對應(yīng)到來源。采樣完成后必須在適當(dāng)溫度下以最快速度將樣品進(jìn)行包裝、做好標(biāo)記和相關(guān)記錄，以最快方式送往具有檢測資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室。如樣品能在采集后24h 內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，則可放在4℃左右的容器中暫時(shí)存放。若在24h 內(nèi)不能將樣品送往實(shí)驗(yàn)室，需將樣品放置于-20℃冷凍保存。如需長期保存應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3 次）。

4.3 廢棄物處理

采樣結(jié)束后，做好場地、物品、個(gè)人防護(hù)用品的消毒和無害化處理。對不同場點(diǎn)盡量安排不同的采樣人員，避免交叉污染。