支氣管肺泡灌洗液生物標志物檢測在呼吸機相關性肺炎診治中的應用進展

周澤紅，譚家余，黃湘

(1.廣東醫科大學，廣東 東莞 523808；2.廣州中醫藥大學附屬中山中醫院檢驗科，廣東 中山 528400；3.中山市博愛醫院中心ICU，廣東 中山 528403；4.佛山市婦幼保健院產前診斷中心，廣東 佛山 528300)

呼吸機相關性肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)是指患者接受機械通氣48 h后發生的感染性炎癥，診斷和治療較為困難，發病率和病死率均較高[1]。一項國內多中心、觀察性的流行病學研究顯示，VAP的發病率為4.5例/1 000機械通氣日，28 d死亡率高達45%[2]。目前VAP的診斷方法包括臨床診斷標準、臨床肺部感染評分、病原微生物培養、急性生理學和慢性健康狀況評價Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHEⅡ)等，然而這些方法均存在不足之處。VAP的發生極大地危害患者的生命健康，若不能盡早診斷、盡早規范治療將嚴重影響患者的預后。生物標志物檢測具有快速、高效的優勢，可用于VAP的早期診斷和鑒別診斷。現已證明血清生物標志物如C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)對下呼吸道感染的診斷具有較高的靈敏度，但在VAP的鑒別診斷方面特異度較低[3-5]。近年來研究發現，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中生物標志物如可溶性髓樣細胞觸發受體-1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1，sTREM-1)、穿透素-3(pentraxin 3，PTX3)的檢測能提高VAP早期診斷的準確性，改善患者預后[6-7]。現就目前臨床常用的BALF生物標志物的研究進展進行綜述。

1 傳統生物標志物

1.1CRP CRP是系統性炎癥的急性期標志物，也可能是肺部免疫系統的局部調節劑，連續監測CRP水平已被廣泛用于感染性疾病的診斷和療效觀察[8]。因BALF標本來源部位的特異性，檢測BALF中CRP對VAP的診斷具有一定幫助并可聯合其他生物標志物提高VAP的診斷效能；且經動態監測BALF發現CRP水平變化與疾病進程相關，即在確診VAP時達峰值，隨著病情的好轉而呈下降趨勢[9]。同時，CRP可聯合其他炎癥標志物如PCT、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)用于VAP的早期診斷和療效觀察[10]。因此，CRP對VAP的診治具有重要價值。

1.2PCT PCT已被證實為細菌性感染的早期預測和療效觀察指標，已普遍用于細菌性感染性疾病的診斷和預后評估。多個團隊的研究結果顯示，BALF中PCT診斷VAP的靈敏度可達55%以上，特異度在80%以上，且其濃度呈現隨疾病的加重而升高、隨疾病好轉而降低的變化趨勢，提示BALF中PCT的檢測對VAP早期診斷及預后評估具有較高的應用價值[11-15]。但丁磊和王振洲[16]研究發現，疑診VAP組、確診VAP組及無VAP組患者BALF中PCT及CRP水平比較差異無統計學意義，而血清PCT、CRP水平比較差異有統計學意義，血清PCT、CRP可作為VAP的早期診斷指標。上述多項研究結果和結論差異較大的原因：①PCT的檢測方法不同；②BALF標本采集前未排除抗生素的影響；③研究樣本量不同以及BALF標本質量的差異。雖然研究結果存在爭議，但綜合評估后發現血清和肺泡灌洗液PCT對于VAP的早期診斷、療效觀察和預后評估仍具有潛在的應用價值。

1.3TNF-α TNF-α是早期炎癥因子，由單核-巨噬細胞和淋巴細胞激活后產生，具有廣泛的作用。TNF-α是肺炎早期發生發展中主要的促炎因子，引起白細胞在炎癥部位聚集，早期具有一定的保護作用，一旦炎癥的促炎和抑炎平衡被打破產生失控的炎癥風暴就會引起肺損傷。經動物實驗證實，在VAP的發生發展中，病原體可能通過Toll樣受體、病原體相關分子模式通路和(或)核因子κB信號通路激活肺泡巨噬細胞產生大量的TNF-α破壞促炎和抑炎的平衡，從而募集中性粒細胞和淋巴細胞等效應細胞聚集造成肺損傷，且銅綠假單胞菌菌液滴注誘導VAP后小鼠肺組織中TNF-α以及肺泡灌洗液中TNF-α水平顯著升高[17-18]。在豬VAP模型的動物實驗研究中，BALF和氣道分泌物培養對VAP的診斷具有較高的準確性，且聯合TNF-α檢測能顯著提高VAP的診斷準確性[19]。程紅斌[20]研究發現，VAP患兒急性期血清TNF-α水平高于恢復期和正常對照組患兒，BALF中TNF-α水平高于血清TNF-α水平，表明TNF-α作為一種早期的炎癥因子參與VAP的發生發展過程。因此，BALF中TNF-α可作為VAP早期診斷和疾病預后的指標。

1.4IL

1.4.1IL-6 IL-6是一種多功能細胞因子，在急性期炎癥反應、免疫反應和造血中發揮重要作用，其在感染性疾病、免疫性疾病及腫瘤等疾病中表達增加。血清IL-6可作為VAP患者預后的標志物，并且在維生素D治療后逐漸降低，以減輕炎癥損傷[21]。VAP患者肺部IL-6表達升高的機制可能是病原體通過c-Jun氨基端激酶信號通路介導的炎癥反應而實現[22]。史躍杰和陳麗敏[23]檢測63例新生兒VAP患兒血清和BALF中IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α水平,并按照患兒預后情況分為預后良好組(41例)和預后不良組(22例)，發現預后不良組患兒BALF中IL-6、IL-8明顯高于預后良好組，而抑炎因子IL-2水平明顯低于預后良好組。由此證實，BALF中IL-6水平有助于評估VAP患者的預后。臨床醫師可通過檢測BALF中IL-6和IL-8水平，評估VAP患兒預后情況，及時調整治療方案，改善患兒預后。

1.4.2IL-1β IL-1β是常見的促炎因子，主要由單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞和非免疫細胞分泌，肺部感染時，IL-1β誘導中性粒細胞和其他炎癥細胞的趨化形成炎癥風暴，進而引起肺損傷。IL-1β在呼吸機相關性肺損傷的發生發展中起重要作用，在呼吸機相關性肺損傷大鼠模型中證實，呼吸機相關性肺損傷大鼠的血清和BALF中IL-1β水平顯著升高，并且隨著抗炎藥物的治療和病情好轉后逐漸下降[24]，因此，檢測BALF中IL-1β水平對VAP的早期診斷具有較大幫助且能作為療效觀察指標。Morris等[25]通過分析BALF中多種炎癥標志物濃度發現，以10 pg/mL為臨界值時，IL-1β診斷VAP的陰性似然比為0.09；以 2 ng/mL為臨界值時，BALF中IL-8診斷VAP的陽性似然比可達5.03，BALF中IL-1β、IL-8是目前VAP鑒別診斷的最強標志物。這一發現對VAP患者抗生素的管理具有潛在的應用價值。

1.4.3IL-8 IL-8是單核-巨噬細胞、上皮細胞受感染、炎癥等刺激而分泌的趨化因子，對中性粒細胞具有較強的趨化作用，在肺部感染性疾病的發生發展中扮演重要角色[26]。BALF中IL-8的檢測在成人和新生兒VAP的診斷中均展現出較好的應用價值，鄧毅等[27]對新生兒VAP與非VAP患兒BALF和血清IL-1、IL-6、IL-8等炎癥標志物檢測發現，兩組通氣48、96 h BALF中上述炎癥標志物比較差異有統計學意義，并隨著時間的推移各炎癥標志物在VAP組BALF中逐漸升高，其中IL-8變化最顯著。由此可見，IL-8可作為新生兒VAP的診斷指標。

IL-8的檢測還可用于VAP的排除性診斷，并指導抗生素管理，即早期檢測到VAP患者BALF中IL-1β、IL-8水平低于設定的閾值時停用抗生素。Hellyer等[28]對12個重癥監護病房、大樣本量的研究證實IL-1β是較好的VAP預測指標，并且發現聯合檢測IL-1β、IL-8對VAP排除性診斷的靈敏度為100%，特異度為44.3%，測試后概率為0%。根據這一結果該團隊隨后提出假設：若BALF中IL-1β、IL-8低于之前設定的診斷臨界值，能減少抗生素的使用，并于2013年注冊實施了17個醫院、24個重癥監護病房的多中心雙盲隨機對照試驗對該假設加以證實[29]。但IL-8等炎癥標志物在VAP患者抗生素管理方面的作用需要更多隨機對照試驗加以驗證。

1.5中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE) NE是絲氨酸蛋白酶超家族成員之一，來源于中性粒細胞、單核細胞、T 淋巴細胞和肥大細胞。在VAP的病理機制中，中性粒細胞大量聚集于肺泡并釋放大量的NE等蛋白水解酶，NE是重要的炎癥損傷因子，是引起急性肺損傷炎癥級聯反應的主要終效應因子，其主要通過消化和降解細胞外基質及上皮連接結構導致肺損傷。在VAP患者BALF中觀察到NE的質量和活力均顯著升高，以670 ng/mL為臨界值，NE診斷VAP的靈敏度為93%、特異度為79%[30]。BALF中NE水平與VAP的進展具有相關性，在未發生VAP前血清和BALF中NE水平較低，發生VAP時血清和BALF中NE水平顯著增高，隨著治療進行和病情好轉，血清和BALF中NE水平下降，但在病情惡化和死亡患者血清和BALF中NE持續升高；且BALF中NE水平與臨床肺部感染評分、血清CRP、PCT以及全血白細胞呈正相關，提示BALF中NE的檢測對于VAP的診斷、療效觀察和預后評估具有較高的應用價值[31]。NE水平和活性增加而NE抑制劑濃度和活性下降導致肺炎患者難以康復，NE抑制劑的應用能改善此狀況、促進細胞因子的適量釋放及病原菌的清除[32]。提示NE可作為VAP治療的新靶標。

2 新型生物標志物

2.1sTREM-1 sTREM-1是表達于中性粒細胞和單核/巨噬細胞表面的受體，屬于免疫球蛋白超家族成員，可在血液以及體液中檢測到。sTREM-1是近年來發現的感染性疾病早期診斷的敏感性指標，機械通氣72 h后發生VAP的患者血清sTREM-1水平顯著高于非VAP患者，以165.05 pg/mL為臨界值時，機械通氣72 h的sTREM-1診斷VAP的靈敏度為90%，聯合PCT檢測能顯著提高診斷的靈敏度和特異度，因此血清sTREM-1可作為VAP的可靠預測指標[33]。BALF中sTREM-1水平診斷VAP的靈敏度和特異度均高于血清CRP、PCT和sTREM-1，而且sTREM-1水平與APACHEⅡ評分均可評估患者預后[34]。BALF中sTREM-1作為VAP的早期預測指標在兒童VAP人群中也展現出較高的應用價值[35]。BALF中sTREM-1在成人和兒童VAP的診斷中均展現出良好的應用前景，且sTREM-1刺激劑為脂多糖，預示著sTREM-1水平可能與細菌的種屬有關，但需更多高質量的研究加以驗證，以使臨床應用標準化。

2.2PTX3 PTX3是由381個氨基酸殘基組成的五肽相關蛋白，屬于五聚蛋白家族的急性期蛋白，由巨噬細胞、中性粒細胞和髓樣樹突狀細胞等組織細胞合成和分泌，常參與機體早期的抗感染反應及異物清除。目前已有研究發現，血清PTX3水平在感染、炎癥等情況下會顯著升高[36-37]。一項納入961例樣本的Meta分析結果顯示，PTX3診斷呼吸道感染的綜合靈敏度為0.78、特異度為0.73，綜合受試者工作特征曲線下面積為0.84；亞組分析顯示血清和BALF中PTX3診斷呼吸道感染的綜合受試者工作特征曲線下面積分別為0.85和0.89，PTX3診斷VAP的綜合受試者工作特征曲線下面積可達0.89，表明PTX3診斷呼吸道感染及VAP具有中等的診斷準確性，BALF中PTX3的總診斷價值優于血清[38]。因此，BALF中PTX3的檢測有助于VAP的早期診斷。

2.3淀粉酶 誤吸是機械通氣患者發生VAP的重要致病機制，包括口咽部分泌物和胃內容物的誤吸。口咽部分泌物中淀粉酶為唾液淀粉酶，胃內容物中的淀粉酶可能來自胰腺，因此無論口咽部分泌物誤吸還是胃內容物誤吸，BALF中均有可能檢測到淀粉酶水平升高。Samanta等[39]研究發現，插管后72 h內發生VAP的患者盲法BALF淀粉酶水平顯著升高，并隨插管前、插管后誤吸風險因素的增加而增加。Qu等[40]對147例機械通氣超過2周的老年患者氣道分泌物淀粉酶進行檢測后也得出相似的結論。淀粉酶作為快速靈敏的指標，已達到自動化分析的程度，對具有誤吸風險的VAP患者的診治具有重要意義。

2.4肝素結合蛋白(heparin-binding protein，HBP) HBP又稱為天青殺素，是來源于多形核白細胞的重要顆粒蛋白，在炎癥過程中大量釋放并具有殺菌、趨化及調節作用。健康人血清中HBP水平較低，一般不超過10 μg/L，發生感染時，菌體本身或細菌釋放的毒素等物質刺激中性粒細胞釋放HBP，從而導致HBP水平升高[41-42]。血清HBP對感染性疾病的診斷具有較高的敏感性和特異性，血清HBP水平升高也有助于VAP的診斷和預后評估，并且HBP聯合APACHEⅡ評分早期診斷VAP的診斷價值優于PCT聯合APACHEⅡ[43]。但BALF中HBP檢測對VAP診斷的研究較少見報道，其原因可能為標本采集較困難。

2.5胰石蛋白 胰石蛋白由胰腺腺泡細胞合成和分泌，是胰腺的分泌產物，以可溶形式分布于生理狀態的胰腺組織、胰液和血清中，其生物學作用尚不清楚，被證實在感染性疾病特別是ICU膿毒癥患者診斷和預后研究中具有較高的應用價值[44]。血清中胰石蛋白水平能作為VAP的診斷指標和預后指標[45]，梁添書等[46]連續監測疑診VAP患者第1、4、7、14天及停呼吸機時血清胰石蛋白水平發現胰石蛋白水平隨VAP的進展而升高，治療后濃度下降，因此胰石蛋白可作為VAP診斷和預后評估指標。BALF中胰石蛋白的檢測有助于VAP的早期診斷，且BALF中胰石蛋白診斷VAP的受試者工作特征曲線下面積可達0.91，具有較高的靈敏度和特異度[47]。胰石蛋白除在胰腺中高表達外，在肝、腎、腦和肺中也存在高表達，且肺組織是其主要表達區域[48]。因此，BALF中的胰石蛋白可作為VAP的早期診斷指標。

2.6肺泡表面活性物質蛋白D(alveolar surface active substance protein D，SP-D) SP-D是一種豐富的肺表面活性劑相關蛋白，在肺的局部防御和免疫調節等過程中起重要作用，可與多種肺病原體結合，增強肺部調理作用而清除病原體。SP-D不僅可增強固有免疫細胞對病原體的清除，調節細胞因子和炎癥反應，還可以調節適應性免疫應答并與多種肺部疾病密切相關。王鸝鸝等[49]研究發現，肺炎患兒BALF中SP-D水平顯著升高，且與BALF中中性粒細胞數量呈負相關，提示SP-D作為一種保護性因子在調節免疫及炎癥反應中發揮著重要作用。

SP-D是新進發現的肺部特異性標志物，診斷肺部疾病的特異性較高，在VAP的診斷中具有潛在的應用價值。Said等[50]通過檢測兒科機械通氣患兒BALF中SP-D并計算臨床肺部感染評分發現，BALF培養陽性患兒BALF中SP-D水平顯著高于培養陰性組患兒；與感染肺炎克雷伯菌或金黃色葡萄球菌的患兒相比，感染銅綠假單胞菌的患兒SP-D水平增加更顯著，SP-D水平與細菌種屬相關；BALF中SP-D水平升高先于臨床肺部感染評分和BALF培養結果變化。Tekerek等[51]對成人VAP和非VAP患者血清中CRP、PCT、PTX3和SP-D水平進行比較發現，血清SP-D是診斷VAP最敏感的生物標志物，可作為鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的早期特異性生物標志物。

3 生物標志物的聯合檢測

單個生物標志物檢測對VAP診斷的敏感性和特異性均不能滿足臨床需求，易出現漏診情況，因此，主張多種標志物聯合檢測。Grover等[52]通過比較確診VAP、非VAP、無機械通氣無感染患者BALF和血清中多項生物標志物水平的差異，篩選并構建了包含BALF單核細胞表面髓樣細胞觸發受體-1與血清單核細胞表面髓樣細胞觸發受體-1比值、BALF單核細胞表面人整合素AM(mCD11b)與血清單核細胞表面人整合素AM(mCD11b)比值、BALF sTREM-1、IL-8、IL-1β以及血清CRP、IL-6的7項生物標志物的組合模型，該模型能準確鑒別出VAP患者。Antcliffe等[53]檢測VAP患者血清中包含細胞因子、氧化脂類等51種炎癥標志物的結果顯示，5,6-二羥基二十碳三烯酸、8,9-二羥基二十碳三烯酸、細胞間黏附分子-1、IL-6和IL-8的多元模型可以鑒別VAP患者與無感染的腦損傷患者，標志物聯合檢測VAP的診斷價值更高。

4 小 結

BALF中生物標志物可反映肺部炎癥的嚴重程度，對VAP的早期診斷和預后評估具有較高的應用價值。但生物標志物檢測受BALF標本質量、抗生素、檢測方法的影響，因此，后續研究應由專業熟練的醫師采集BALF標本、統一檢測方法、排除抗生素對各個標志物檢測的影響，增加樣本量以及采用隨機對照試驗的方法對BALF生物標志物在VAP診治中的應用價值加以證實。VAP患者BALF中多種生物標志物濃度顯著升高，但其升高的具體機制尚未清楚，且各個標志物的檢測尚未標準化。若能解決以上兩個問題，BALF中生物標志物有望成為VAP診斷、療效觀察及預后評估的重要指標。