m6A甲基化修飾與消化道惡性腫瘤關系的研究進展

張璐瑤，汪麗鈺，陳乾，時建明

(南京醫(yī)科大學姑蘇學院 南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 蘇州 215008)

惡性腫瘤是一種全身性的基因性疾病，在內(nèi)因及外因的共同作用下，正常細胞發(fā)生一系列基因突變，機體內(nèi)腫瘤細胞過度增殖導致腫瘤形成[1]。早在20世紀70年代，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine，m6A)甲基化修飾已被發(fā)現(xiàn)[2-4]，其是最普遍的RNA分子表觀遺傳修飾，但由于檢測技術的限制，m6A甲基化修飾的具體功能及作用機制仍不明確。有證據(jù)表明，m6A甲基化修飾在信使RNA(messenger RNA，mRNA)前體剪接、3′端加工、核輸出、翻譯調(diào)控、mRNA降解和微RNA加工中起關鍵作用[5]。m6A甲基化修飾調(diào)控紊亂可能影響mRNA的加工、降解以及翻譯過程，導致癌基因的激活及抑癌基因的失活，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥的發(fā)生密切相關，因此m6A甲基化修飾迅速成為國內(nèi)外研究的熱點之一。

目前，惡性腫瘤已進入精準治療時代，但消化道惡性腫瘤的治療手段仍較局限，尤其是缺乏靶向治療、免疫治療的有效治療靶點和生物標志物，且患者5年生存率仍較低?，F(xiàn)對m6A甲基化修飾與消化道惡性腫瘤的相關研究進展予以綜述，旨在為判斷腫瘤預后、尋求逆轉腫瘤放化療抗性和分子靶向治療的新策略提供新的線索。

1 m6A甲基化的概述

1.1m6A甲基化相關概念 據(jù)RNA修飾通路數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，截至2017年底，已在所有已知生物體中發(fā)現(xiàn)了約163種RNA化學修飾[6]。在這些化學修飾中，m6A甲基化修飾最普遍、豐度最高、最保守[2,7]，在最簡單的細菌以及復雜動物的幾乎所有類型的RNA中均存在m6A甲基化修飾。m6A甲基化修飾作為一種極其重要的RNA修飾，可調(diào)節(jié)關鍵的細胞過程，包括腫瘤干細胞更新以及細胞增殖、分化、對脫氧核糖核酸損傷的反應等[8]，一旦相關細胞過程失調(diào)，則導致疾病發(fā)生，尤其是惡性腫瘤。

1.2m6A甲基化修飾相關酶 m6A甲基化修飾過程可逆，且有多種酶(腺苷甲基轉移酶、去甲基化酶和RNA結合蛋白)參與，此類酶可促進、去除和識別m6A甲基化修飾位點，并傳遞m6A甲基化修飾信號至多個生物學過程[9]。參與m6A甲基化修飾的酶的異常，將導致一系列疾病(惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)性疾病、肥胖、不孕、胚胎發(fā)育遲緩等)的發(fā)生[10-11]。參與m6A甲基化修飾的酶包括①腺苷甲基轉移酶，又稱寫入復合物，主要由甲基轉移酶樣蛋白(methyltransferase like protein，METTL)3[12]、METTL14[13]、RNA結合基序蛋白15/15B[14]、腎母細胞瘤1關聯(lián)蛋白[15]和vir-like甲基化轉移酶相關蛋白[16]組成，其中METTL3為催化核心，腎母細胞瘤1關聯(lián)蛋白為催化亞基，METTL14作為結構支持，以穩(wěn)定METTL3-METTL14核心復合物，而RNA結合基序蛋白15/15B有助于將復合物募集到靶點，但目前對寫入復合物中vir-like甲基化轉移酶相關蛋白的作用尚未完全了解[17]。②去甲基化酶，又稱去除復合物，包括肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO)[18]和烷基化修復同系物5(alkylation repair homolog 5，ALKBH5)[19]，它們能夠通過氧化作用選擇性地去除含m6A底物中的甲基，從而調(diào)節(jié)基因表達和細胞分化，使RNA甲基化成為一種可逆的動態(tài)調(diào)節(jié)反應。③讀取復合物，包括YT521-B同源(YT521-B homologous，YTH)結構域蛋白[20]、真核起始因子3[14]、人胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白家族[21]和核不均一核糖核蛋白家族[22]，它們可以選擇性地識別mRNA的m6A位點，并參與下游翻譯，提高mRNA出核速度并介導mRNA的降解等[23]。

1.3m6A甲基化的檢測方法 在各種功能性RNA分子中存在大量的核苷酸修飾，其中最常見的內(nèi)部修飾包括m6A、N1-腺苷酸甲基化、5-甲基胞嘧啶等[24]。因此，特定位置RNA修飾的檢測十分必要，對后續(xù)鑒定影響RNA修飾的條件以及篩選負責修飾的相關基因和酶有關鍵作用。隨著高通量測序技術的出現(xiàn)，目前m6A甲基化檢測方法飛速發(fā)展。經(jīng)典的檢測技術主要有m6A甲基化RNA免疫共沉淀測序法[25-26]，它是應用抗原抗體相結合的方法，利用m6A特異性抗體與帶有m6A的mRNA片段的結合、富集、純化進行高通量測序，該方法操作簡單、快速方便，僅能鑒定mRNA上m6A甲基化程度較高的區(qū)域，并且僅能將m6A定位在100～200 nt長度，無法獲得單個堿基甲基化水平。隨后，m6A單核苷酸紫外交聯(lián)免疫共沉淀測序法出現(xiàn)[27]，該方法利用特異性抗體誘導逆轉錄過程中的突變和截斷，從而鑒定單個核苷酸水平的甲基化修飾，但該方法涉及紫外交聯(lián)及P32同位素標記，操作更加復雜，成本較高，故日常實驗室中的應用相對較少。

基于以上兩種方法的局限性，目前m6A甲基化檢測新方法的研究仍在進行。RNA修飾后核酸雙鏈體熔解特性發(fā)生改變，Golovina等[28]利用高分辨率熔解曲線分析并快速篩選出RNA中發(fā)生m6A甲基化修飾的特異性位點，該方法是一種簡單、快速、低成本的聚合酶鏈反應擴增后檢測技術。此外，中山大學駱觀正教授團隊與美國芝加哥大學何川教授領導團隊合作開發(fā)了一種新型m6A甲基化水平鑒定方法，稱為m6A敏感性RNA內(nèi)切酶測序法，該方法突破了大樣本量的限制，且不需要依賴特異性抗原，僅通過特異性RNA內(nèi)切酶——毒素蛋白MazF，就能實現(xiàn)對m6A甲基化水平的檢測，且能夠精確到單堿基分辨率水平[29]。毒素蛋白MazF檢測RNA底物靈敏度、特異度均較高，在樣本量非常有限的前提下也能發(fā)揮作用，且實驗設計快速簡化，不需要抗體富集，大大縮短了樣品制備時間，在很大程度上擴大了m6A甲基化修飾的研究范圍。

2 m6A甲基化修飾與消化道腫瘤的關系

隨著m6A檢測方法的不斷優(yōu)化，m6A的相關研究范圍也不斷擴大。最近的研究已經(jīng)證明，m6A甲基化修飾與多種消化道惡性腫瘤密切相關，如胃癌[30]、結直腸癌[31]、肝細胞癌[32]、胰腺癌[33]、食管癌[34]等，其相關修飾酶可作為癌基因或抑癌基因在惡性腫瘤的增殖[35]、分化、發(fā)生[36]、侵襲[36]和轉移[37]中起關鍵作用。

m6A甲基化修飾涉及多種修飾酶的作用，它們是調(diào)節(jié)癌變和腫瘤進展的主要因素。然而，由于惡性腫瘤的高度異質性，不同修飾酶在不同腫瘤中存在雙重作用(抑制或促進腫瘤生長)。當m6A調(diào)控基因改變或與m6A甲基化相關酶的表達變化時，m6A靶向基因mRNA的水平將發(fā)生變化，從而導致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過系統(tǒng)性的回顧可了解m6A甲基化修飾對不同類型消化道腫瘤的調(diào)控作用。

2.1m6A甲基化修飾與胃癌 胃癌是第五大惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，2018年全球新發(fā)胃癌病例超過100萬，死亡約78.3萬[38]。近年來，胃癌病死率有所下降，但由于大多數(shù)患者確診時已為晚期，臨床治療效果較差。因此，胃癌發(fā)病的分子機制和治療靶標仍需進一步探索。

通過基因集富集系統(tǒng)性地分析m6A在胃癌中的生物學功能發(fā)現(xiàn)，寫入復合物以及讀取復合物是潛在的腫瘤抑制信號，而去除復合物則是胃癌的致癌信號。其中，可通過敲除METTL14的表達降低m6A水平激活Wnt和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號轉導通路，以促進胃癌細胞的增殖和侵襲，而通過敲除FTO表達增加m6A甲基化修飾則會逆轉分子信號通路，達到相反的效果[30]。然而，作為腺苷甲基轉移酶之一的METTL3基因則具有致癌作用，敲除METTL3基因可以降低B細胞淋巴瘤-2的表達，增加B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白和胱天蛋白酶3的活性，促進腫瘤細胞凋亡。此外，下調(diào)METTL3的表達可導致磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路失活，從而抑制胃癌細胞的增殖和遷移[39]。由此可見，METTL3和METTL14均屬于腺苷甲基轉移酶，但在胃癌中的作用卻相反，這可能由腫瘤微環(huán)境的復雜性和高度的腫瘤異質性所致，還值得進一步探究。

2.2m6A甲基化修飾與結直腸癌 結直腸癌是全球高發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，2018年全球結直腸癌新發(fā)病例超過180萬，死亡88.1萬[38]。由于多數(shù)結直腸癌患者就診時已為晚期，且疾病進展快、易發(fā)生遠處轉移，因此需要進行廣泛深入的研究以提高結直腸癌的診斷和治療水平，并預測其復發(fā)風險。

Zhang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，腎母細胞瘤1關聯(lián)蛋白與碳酸酐酶Ⅳ相關，其通過靶向腎母細胞瘤1結合蛋白-腎母細胞瘤1-轉導素β樣蛋白1軸抑制Wnt信號傳導，抑制腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡和細胞周期停滯。Deng等[40]研究發(fā)現(xiàn)，METTL3陽性表達與較長的存活時間顯著相關，且METTL3過表達可抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而METTL3下調(diào)則顯示出相反結果。此外，METTL3的下調(diào)可導致磷酸化-p38抗體和磷酸化-胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活化，p38或胞外信號調(diào)節(jié)激酶抑制劑可以顯著逆轉METTL3基因敲除所誘導的遷移和侵襲。故推測，METTL3可能通過p38/胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路抑制結直腸癌的增殖、遷移和侵襲，因此，可將METTL3作為結直腸癌發(fā)生、發(fā)展新的標志物。Liu等[41]分別對結腸腺癌標本及直腸腺癌標本進行細化研究發(fā)現(xiàn)，在結腸腺癌標本中，與正常組織相比，除METTL14、YTHDF3下調(diào)外，其他所有寫入復合物及讀取復合物均顯著上調(diào)；而直腸腺癌標本與正常組織中的腎母細胞瘤1關聯(lián)蛋白、METTL16、核不均一核糖核蛋白C、YTHDC1比較差異無統(tǒng)計學意義。Yang等[42]的研究證實，結腸腺癌和直腸腺癌標本中去除復合物ALKBH5的表達均明顯弱于正常組織，但兩者中FTO的表達比較差異無統(tǒng)計學意義。Liu等[41]進一步通過單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期及高METTL3表達是結腸癌無復發(fā)生存期的重要預后因素，TNM分期和年齡是總生存期的預后因素，而TNM分期是直腸癌無復發(fā)生存期的唯一預后因素，年齡、TNM分期以及METTL14、METTL16和ALKBH5的表達對總生存期有重要影響；進一步的多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期是結腸癌患者總生存期的獨立危險因素，而METTL14、ALKBH5的表達以及TNM分期是直腸癌患者總生存期的獨立危險因素。可見，m6A相關基因表達失調(diào)在結直腸癌進展中發(fā)揮重要作用，有望成為判斷結直腸癌患者預后的臨床生物標志物。

2.3m6A甲基化修飾與肝細胞癌 肝癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，全球每年新發(fā)肝癌病例約84.1萬，死亡約78.2萬[38]。目前肝癌的發(fā)病原因已明確，尤其在亞洲地區(qū)，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒是肝癌發(fā)生發(fā)展的主要危險因素。由于多數(shù)患者就診時已為中晚期，且處于肝硬化失代償狀態(tài)，治療效果欠佳。因此，從分子機制層面了解肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展對于推進診斷、治療及判斷預后至關重要。

通過綜合性分析m6A甲基化修飾相關酶在人類肝癌中的表達，Zhou等[32]發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中的METTL3、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3和真核起始因子3均上調(diào)，且METTL3和YTHDF1是肝癌的獨立不良預后因素，均可調(diào)節(jié)肝癌細胞周期、RNA剪接、DNA復制、堿基切除修復和RNA降解。進一步從分子機制層面分析發(fā)現(xiàn)，METTL3可促進腫瘤抑制基因細胞因子信號轉導抑制因子2 mRNA 3′端的m6A甲基化修飾，從而通過YTHDF2依賴機制促進細胞因子信號轉導抑制因子2 mRNA的降解，敲除METTL3的表達可以顯著降低肝癌細胞的增殖、遷移和集落形成[43]。此外，METTL14同樣作為腺苷甲基轉移酶，其下調(diào)是肝細胞癌無復發(fā)生存期的不良預后因素之一，下調(diào)METTL14可以減弱miR-126的表達，從而促進肝癌轉移[37]。綜上分析，不同m6A 寫入復合物可能在肝癌進展過程中起致癌(或抑癌)作用，METTL14作為肝癌的抑癌基因，與其他m6A寫入復合物的作用相反，這可能與肝癌細胞的異質性有關，仍需進一步研究。通過比較分析不同肝細胞癌患者的癌組織和正常組織發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌細胞核中去甲基化酶FTO表達降低，且與AFP水平、腫瘤大小、遠處轉移和脈管浸潤相關，F(xiàn)TO表達降低患者的總生存期和無瘤生存期相對縮短[44]。在分子機制上，F(xiàn)TO通過M2型丙酮酸激酶的去甲基化，促進翻譯產(chǎn)物產(chǎn)生，而敲除FTO基因表達可以抑制腫瘤增殖和體內(nèi)生長，誘導肝癌細胞G0/G1期阻滯[45]，表明FTO可能是肝細胞癌患者預后不良的重要預測因子。

2.4m6A甲基化修飾與胰腺癌 胰腺癌惡性程度較高，盡管多學科綜合治療不斷發(fā)展，但胰腺癌發(fā)現(xiàn)時往往已為晚期，患者的預后仍較差。因此，探索m6A甲基化修飾在胰腺癌中的機制至關重要。Xia等[33]對40例胰腺癌患者進行系統(tǒng)性研究發(fā)現(xiàn)，METTL3高表達患者分期相對偏晚、淋巴結轉移數(shù)量較多、生存率偏低，且與癌旁組織相比，腫瘤組織標本中的METTL3蛋白和mRNA水平明顯增高；敲除METTL3基因表達減少mRNA m6A甲基化修飾后，癌細胞增殖、侵襲和遷移減弱。因此，METTL3可能與胰腺癌發(fā)生有關，并可能作為胰腺癌預后指標或治療靶點應用于后續(xù)治療中。

去除復合物(如ALKBH5)也是胰腺癌總生存率的重要預測因子之一，ALKBH5高表達患者的總生存期相對較長，說明其對胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有積極作用[46]。此外，Tang等[47]發(fā)現(xiàn)，通過吉西他濱建立的人源腫瘤組織異種移植模型的去甲基化酶ALKBH5表達下調(diào)，而沉默ALKBH5能顯著增加胰腺癌細胞在體內(nèi)外的增殖、遷移和侵襲，而ALKBH5過度表達則導致相反的結果。由此可見，腺苷甲基轉移酶高表達以及去甲基化酶低表達均在胰腺癌中占關鍵地位，而讀取復合物在胰腺癌中的作用仍有待研究。

2.5m6A甲基化修飾與食管癌 食管癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第七位，死亡率位居全球惡性腫瘤的第六位[38]。Yang等[34]分析食管癌鱗癌組織與鄰近正常組織的差異發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中YTHDC2表達下調(diào)，并通過細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，敲除YTHDC2基因可促進細胞生長，而YTHDC2過表達時效果則相反，說明YTHDC2在食管鱗癌中發(fā)揮抑癌基因的作用；同時該研究從分子機制層面觀察到一些重要的癌癥相關通路被激活，包括p53、核因子κB、Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子等信號通路。進一步對生存曲線的分析發(fā)現(xiàn)，ALKBH5、YTHDF2和METTL14的高表達與食管癌患者生存期延長呈正相關，而核內(nèi)不均一核糖核蛋白C和WTAP的高表達則與總生存期呈負相關[48]，表明m6A 甲基化修飾相關酶在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，有望成為預測食管癌預后的重要分子標志物。

3 m6A甲基化修飾與消化道腫瘤的治療

m6A甲基化修飾受到寫入復合物(METTL3、METTL14、WATP等)、讀取復合物(YTH結構域蛋白、核不均一核糖核蛋白蛋白家族)和去除復合物(FTO、ALKBH5等)的調(diào)節(jié)，上述組成基因表達的變化將引起mRNA表達水平的改變，從而導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲。因此，m6A甲基化修飾的相關調(diào)節(jié)劑或抑制劑可能是惡性腫瘤的潛在治療策略。

在靶向治療方面，碳酸酐酶Ⅳ可通過靶向腎母細胞瘤1結合蛋白-腎母細胞瘤1-轉導素β樣蛋白1軸抑制Wnt信號轉導，進而抑制結腸癌患者腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡和細胞周期停滯[31]。METTL3通過p38/ERK通路抑制結直腸癌的增殖、遷移和侵襲[40]。此外，Huang等[49]研究發(fā)現(xiàn)了一種高度選擇性的FTO抑制劑——甲氯芬酸(一種非甾體抗炎藥)，其可與FTO結合位點競爭結合，增加m6A甲基化修飾，從而抑制腫瘤進展。

在化放療方面，去甲基酶ALKBH5過表達可提高胰腺癌細胞對化療的敏感性[47]。而敲除胰腺癌細胞株METTL3基因表達的患者對吉西他濱、5-氟尿嘧啶和順鉑等抗腫瘤藥物以及放療的敏感性較高，提示METTL3是提高胰腺癌療效的有效靶點[50]。在食管癌中，METTL3表達與食管癌復發(fā)有關，提示METTL3過表達可能是食管癌患者鉑類藥物耐藥的關鍵因素，因此調(diào)節(jié)METTL3的表達可能是提高鉑類藥物療效的新方法[51]。

在免疫調(diào)節(jié)方面，通過敲除FTO基因表達可增加腫瘤細胞免疫治療敏感性[52]。Li等[53]發(fā)現(xiàn)，mRNA m6A甲基化修飾通過靶向白細胞介素-7/信號轉導及轉錄激活因子5/細胞因子信號轉導抑制因子通路調(diào)控T細胞穩(wěn)態(tài)，m6A甲基化修飾相關酶作為T細胞分化的關鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤免疫系統(tǒng)調(diào)控及腫瘤生長和播散中發(fā)揮重要作用。

4 展 望

近年來，隨著m6A甲基化修飾檢測技術的發(fā)展，關于m6A甲基化修飾及其相關酶在腫瘤中作用的研究已經(jīng)取得實質性進展。m6A甲基化修飾是一把“雙刃劍”，一些基因的過度修飾可能改變RNA剪接和翻譯能力，導致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而有些基因在缺乏m6A甲基化修飾時，可能導致腫瘤發(fā)生。由于腫瘤的異質性，相同寫入復合物、去除復合物、讀取復合物在不同腫瘤中的作用亦不同，可表現(xiàn)為癌基因或抑癌基因，但均通過蛋白質表達的失調(diào)引發(fā)或促進腫瘤進展，這為腫瘤的治療指明了方向。針對m6A甲基化修飾的相關酶在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控機制仍需深入探索，未來關于m6A甲基化修飾功能的研究將有重大突破，其中恢復m6A甲基化的理想水平是治療的關鍵，更多m6A甲基化修飾相關酶的調(diào)節(jié)劑和競爭性拮抗劑的發(fā)現(xiàn)，對精準、有效的m6A靶向藥物的研發(fā)具有重要意義。