氧化應激介導的細胞凋亡在阿爾茨海默病中的作用

張立敏，顧超，安紅梅

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院腦病科，上海 200032)

隨著年齡的增長，阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的患病率逐年升高，給患者家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。AD的主要病理特征是β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成的老年斑和高磷酸化Tau蛋白形成的神經元纖維纏結，最終導致神經元和突觸丟失，盡管AD中神經變性的發病機制有待進一步闡明，但與年齡相關的氧化應激損傷是AD早期發生、發展的核心因素[1-2]。氧化應激作為一種級聯反應，由氧化和抗氧化系統不平衡導致，其特征是機體內活性氧類(reactive oxygen species，ROS)、活性氮類(reactive nitrogen species，RNS)等自由基的顯著升高；機體代謝過程中不斷產生自由基，而抗氧化酶、抗氧化蛋白通過清除自由基維持氧化還原平衡[3]。腦作為高耗氧器官，其抗氧化能力較弱，易發生氧化應激損傷。在AD疾病早期，神經元內異常聚集的Aβ和磷酸化Tau蛋白可作為ROS的效應分子逐漸沉積[4]；異常沉積的Aβ和Tau蛋白導致二價鐵離子、銅離子等過渡金屬離子增加和線粒體功能障礙，氧化還原失衡所致的ROS增加、抗氧化酶活性改變以及各種凋亡信號通路的相互影響均可導致神經細胞凋亡，加速AD的發生[5-6]。現就氧化應激介導的細胞凋亡在AD中的作用予以綜述。

1 線粒體介導細胞凋亡在AD中的作用

線粒體不僅是細胞能量代謝的中心，也是氧化還原反應的主要場所，線粒體氧化損傷和ROS的相互作用是AD病理損傷的因素。AD患者腦中神經元細胞色素C(cytochrome C，Cytc)氧化酶活性降低、ATP生成減少、ROS含量增加，線粒體通道中的淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)累積，隨著神經細胞線粒體損傷的加重，AD的嚴重程度增加[7]。另外，APP/PS1轉基因小鼠模型中檢測出60個線粒體相關蛋白表達改變，這些蛋白大多參與了線粒體電子傳遞、三羧酸循環及氧化應激，與神經元凋亡密切相關[8]。采用Aβ孵育人骨髓神經母細胞或過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)孵育PC12細胞，均可誘導ROS生成和線粒體功能障礙，進而導致蛋白質脂質過氧化和DNA氧化損傷，最終導致神經突觸丟失、細胞凋亡[9-10]。因此，明確線粒體氧化應激損傷介導的神經細胞凋亡，可以為AD的早期預防和治療提供依據。

1.1Cytc Cytc是細胞呼吸鏈中重要的電子傳遞體，主要存在于線粒體中。研究顯示，當神經細胞發生氧化應激時，線粒體膜電位下降、Cytc釋放增多、神經突觸丟失、細胞凋亡；而加入ROS阻斷劑N-乙酰半胱氨酸則可顯著抑制細胞內線粒體膜電位下降，減少Cytc釋放以及胱天蛋白酶(caspase)3生成，降低細胞凋亡率[11-12]。神經細胞凋亡途徑與其他細胞大致相同，即氧化應激損傷時線粒體呼吸鏈能量代謝障礙，導致線粒體通透性轉變孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP)不可逆開放，位于線粒體內的Cytc釋放并與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1)形成多聚復合體，活化caspase-9 前體，進而激活下游的caspase-3，啟動細胞凋亡級聯反應[13]。

Aβ作為AD的病理產物，極易損傷胞內神經元線粒體，誘發氧化應激，介導細胞凋亡。Aβ由39～42個氨基酸組成，來源于APP的淀粉樣水解途徑，APP的胞外區首先被β-分泌酶水解，然后在膜雙分子層內Aβ的40或42位氨基酸被γ-分泌酶水解，生成Aβ40或Aβ42[14]。胞內神經元生成的Aβ聚集形成寡聚物，與線粒體外膜轉運酶結合而被內吞，從而抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞和能量代謝，降低細胞色素氧化酶和丙酮酸脫氫酶活性，干擾線粒體裂變和融合，導致胞內谷氨酸和鈣離子(Ca2+)轉運障礙以及線粒體氧化損傷，釋放大量的ROS，最終致蛋白質脂質過氧化、DNA損傷[15-16]。此外，受損的線粒體MPTP不可逆開放，導致線粒體膜電位下降，而位于線粒體內的Cytc等促凋亡蛋白釋放進入細胞質中，啟動神經元凋亡級聯反應[17]。

1.2B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因 Bcl-2位于線粒體膜上，參與調控神經細胞凋亡，其中Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X-protein，Bax)與線粒體的氧化和抗氧化作用密切相關。一方面，Bcl-2是線粒體上MPTP的組成蛋白，可維持正常的線粒體膜電位，抑制pH異常條件下離子通道的形成；另一方面，線粒體上的Bcl-2與Bax結合，封閉Bax形成的孔道的活性，使一些小分子不能通過線粒體外膜進入細胞質，從而起到細胞保護作用[18]。Bax與Bcl-2的作用相反，氧化損傷時下調的Bcl-2不能拮抗Bax形成的孔道的活性，使Cytc、Apaf-1等小分子自由透過線粒體膜，誘導神經細胞凋亡[19]。在應用Aβ或H2O2孵育的PC12細胞中，Cytc和Bax表達上調、Bal-2表達下調，導致神經元凋亡，其凋亡機制與細胞內ROS積累激活Bax、抑制Bal-2活性以及促使Cytc、Apaf-1等促凋亡蛋白釋放有關[20-21]。

神經突觸周圍有大量線粒體，提供神經遞質傳遞和Ca2+流入所需的能量，線粒體極易受到聚集Aβ損傷，導致線粒體電子傳遞和能量代謝障礙、細胞內Ca2+失衡、大量ROS生成，加速Aβ和Tau的病理學作用；同時，逐漸沉積的Aβ和磷酸化的Tau蛋白進一步加劇線粒體損傷，導致線粒體膜電位下降、Bal-2活性受到抑制、MPTP不可逆開放，Cytc、Apaf-1和Bax等促凋亡蛋白釋放進入細胞質中，激活caspase途徑，造成神經元和突觸丟失，進而導致認知障礙和記憶喪失，參與AD的發病[22]，見圖1。

2 ROS-凋亡信號調節激酶1-c-Jun氨基端激酶/p38信號通路介導的細胞凋亡在AD中的作用

ROS作為細胞內氧化應激的效應分子，可引起凋亡相關蛋白的表達，促使信號通路轉導變化。其中，ROS-凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)-c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/p38信號通路的激活與ROS相互作用，加速了神經細胞凋亡和突觸丟失[23-24]。促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是廣泛表達的絲氨酸/酪氨酸激酶，主要包含胞外信號調節激酶(extracellular regulated kinase，ERK)、JNK和p38 MAPK三個家族，ROS觸發的級聯反應依次通過MAPK激酶激酶-MAPK激酶-MAPK通路將細胞外信號轉導至細胞核內，誘導凋亡。

2.1ASK1 ASK1是MAPK激酶激酶家族成員之一，其結構相對保守，在炎癥、缺血和氧化應激損傷導致的細胞凋亡通路活化過程中起橋梁作用。神經細胞氧化應激損傷時，過量的ROS、沉積的Aβ均可磷酸化ASK1的蘇氨酸殘基，磷酸化后的ASK1作為MAPK信號轉導所致神經毒性的上游，啟動細胞凋亡途徑[25-26]。人和鼠的蘇氨酸殘基分別是Thr-838和Thr-845，高表達的磷酸化ASK1激活下游的JNK/p38，通過p53磷酸化誘導細胞核凋亡靶基因的表達；磷酸化的ASK1還可通過活化線粒體相關Bax的表達及caspase-3途徑誘導神經細胞凋亡，參與AD的發病和進展[27]。

2.2JNK/p38 JNK和p38同屬應激活化蛋白激酶。JNK由JNK1、JNK2和JNK3基因編碼形成，編碼后的JNK1/JNK2蛋白在全身廣泛表達，而JNK3則主要表達于神經系統。在AD的小鼠動物模型以及大鼠神經元和人成纖維細胞體外細胞模型中，活化的JNK均參與了磷酸化Tau蛋白的形成，加速了AD的發病[28]。在H2O2誘導的PC12細胞和人神經母細胞瘤氧化應激損傷中，磷酸化的JNK和p38 MAPK的表達上調可導致細胞凋亡[29]。ASK1-JNK通路促進細胞凋亡的機制主要包括：①通過調節線粒體和胞質內的蛋白介導細胞凋亡，如活化Bax等促凋亡蛋白的表達并經caspase途徑誘導神經元凋亡[30]。在PC12細胞中加入ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸可導致磷酸化JNK表達下調、caspase-3表達減少，H2O2誘導的細胞凋亡率降低[31]。②磷酸化的JNK可以由細胞質轉移至細胞核中，促使核內轉錄因子上調，如通過磷酸化p53、c-Jun、c-Fos誘導下游相關凋亡靶基因的表達，上調FasL、腫瘤壞死因子等死亡分子受體的表達[32]。p38與JNK激活及凋亡的機制大致相同，活化后的p38與JNK又可刺激產生大量ROS，形成ROS、MAPK與caspase間相互作用的正反饋機制，從而加速AD的進展[33]，見圖1。

2.3ERK1/2 ERK1/2也是MAPK家族成員，當內環境改變(缺血、氧化、鈣積累等)時，ERK1/2磷酸化導致下游蛋白表達改變，參與細胞增殖、分化及凋亡的調控[34-35]。在H2O2誘導的氧化損傷的環境中，磷酸化ERK1/2表達上調可導致胞內caspase-3水平升高，進而致細胞凋亡[36]。APP/PS1轉基因小鼠神經元以及AD大鼠模型海馬神經細胞中ERK1/2、p38磷酸化表達上調，神經元丟失[37]。由此推測，活化的ERK1/2主要參與AD發病以及氧化應激損傷狀態下神經元凋亡的調控，但其調控機制與p38和JNK的凋亡通路是否相同，還有待進一步驗證。

3 酶類抗氧化系統介導的細胞凋亡在AD中的作用

酶類抗氧化系統是體內對抗ROS的第一道防線，AD患者腦內谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性降低，且伴隨大量蛋白質、脂質過氧化，最終導致細胞凋亡[38]。抗氧化系統功能失衡參與了AD的氧化應激損傷以及神經元、突觸丟失。

3.1抗氧化酶

3.1.1SOD SOD作為機體內清除超氧陰離子的酶，主要分布于線粒體和細胞質中，SOD通過歧化反應將胞內的超氧陰離子生成H2O2和O2。生理情況下，生成的H2O2可以在GPx、CAT等作用下形成H2O和O2，防止胞內H2O2水平過高對機體造成損傷；當氧化損傷發生時，SOD活性受到抑制，生成的H2O2不能被及時清除，通過細胞膜和線粒體與二價鐵離子等其他過渡金屬反應形成毒性更大的羥基，加重氧化應激損傷[39]。SOD在AD發生過程中起保護作用，當小鼠的SOD2基因被敲除時，腦內核酸出現氧化損傷；同樣，SOD缺乏使Aβ水平升高，促使轉基因小鼠癡呆的發生[40]。因此，當神經系統受損時，SOD活性可作為氧化應激損傷程度的重要評價指標。

3.1.2GPx GPx主要分布于線粒體和細胞質中，其不僅可以利用還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)作為底物催化H2O2生成H2O，還可以清除脂質過氧化物。GSH作為GPx的底物主要參與過氧化物的清除，GSH具有抗氧化性可以清除胞內自由基和一些過氧化物。GR通過將氧化型GSH還原成GSH，維持GSH的動態平衡，其中氧化型GSH水平是決定ROS、RNS介導的神經元損傷的關鍵因素，體內氧化型GSH水平的降低需要多種抗氧化酶的參與，以維持GSH/氧化型GSH的比例；在嚴重氧化應激條件下，細胞不能維持適當的GSH/氧化型GSH比例，導致氧化型GSH積累，蛋白質、脂質過氧化修飾[41]。細胞質內GSH是維持質膜完整性和突觸體中ATP水平的關鍵，GSH減少導致細胞內ROS、RNS水平升高，H2O2清除減弱，羥基形成增多，進而觸發氧化應激，導致神經突觸丟失[42]。在H2O2誘導損傷的PC12細胞內，SOD、CAT、GPx、GR活性降低，丙二醛(malondialdehyde，MDA)生成增加，導致細胞凋亡[43]。

3.2脂質、蛋白質過氧化 隨著氧化應激的發生，胞內逐漸堆積的ROS、RNS可抑制抗氧化酶活性，導致胞內大分子蛋白質、脂質過氧化，使蛋白質、脂質出現結構和功能障礙。MDA是細胞內脂質氧化的分解產物，而8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)是DNA分子中鳥嘌呤堿基的第8位碳原子被氧化形成的氧化產物，MDA與8-OHdG的積累表明體內抗氧化酶活性改變導致脂質和DNA氧化損傷。研究表明，AD患者腦脊液中氧化修飾的核苷水平升高，尤其是8-OHdG、MDA水平升高導致總抗氧能力降低[44]。在相同飼養條件下，與野生型小鼠相比，AD模型小鼠尿液中的8-OHdG、H2O2、MDA水平顯著升高[45]。隨著氧化應激損傷的發生，胞內抗氧化酶被過度消耗、抗氧化酶活性受到抑制，氧化與抗氧化失衡，不斷堆積的ROS、RNS使蛋白質、脂質發生過氧化、DNA損傷，誘導神經元和突觸丟失[46]。SOD、CAT、GPx、GR共同構成了機體的抗氧化防御體系，SOD催化產生的H2O2需要GPx、GR和CAT的及時清除，以防止胞內H2O2積累與超氧陰離子反應生成毒性更大的羥基，而SOD清除超氧陰離子可避免CAT與GPx失活[42,45]。當酶類抗氧化系統失衡時，過氧化物及ROS積累，導致神經元內的蛋白質、脂質過氧化以及DNA損傷，最終導致細胞凋亡。因此，維持抗氧化酶活性及胞內抗氧化動態平衡是預防和治療AD的關鍵研究指標。

4 小 結

AD的致病過程是一個多因素、多機制、漸進性的復雜過程，涉及Aβ病理級聯、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥反應、膽堿能缺失以及氧化應激等，其中與年齡相關的氧化損傷積累是AD發病早期的變化之一。ROS作為氧化應激過程中的主要效應分子，可導致蛋白質、脂質過氧化，抑制抗氧化酶的活性，同時可影響線粒體功能，活化caspase-3，還可通過ASK1-JNK/p38信號轉導通路誘導神經細胞凋亡，參與AD的發病。目前AD仍無法治愈，臨床常應用膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑改善患者癥狀。因此，尋找有效的治療手段及藥物以減輕大腦氧化應激損傷，早期防治AD、降低AD的發病率和致殘率，已成為目前AD的重要研究策略及評價指標。