線粒體靶向遞送PCN-224體系的構建與表征

余文杰, 楊明月, 華成煥, 彭 娜 *, 劉 義

(1. 武漢科技大學 化學與化工學院,湖北 武漢 430081; 2. 天津工業大學 化學與化工學院,天津 300387)

光動力療法(PDT)是一種利用光敏劑(PSs)在特定波長的激發光下產生具有細胞毒性的活性氧(ROS),從而誘導細胞凋亡和組織損傷的抗腫瘤治療方法[1]。因此,可以通過調節光照條件(例如光照時間和光照強度)來精確調控光動力治療的效果[2]。然而,ROS的半衰期很短(<40 ns),只能作用于其產生的位點附近(<20 nm),這一范圍遠遠小于細胞尺寸[3],故許多研究者致力于設計、制備多功能納米載體,將各類PSs遞送至腫瘤組織后,進一步將其遞送到相關細胞器(線粒體、溶酶體等),以達到在細胞器附近原位生成ROS的目的,從而提高PDT治療效果[4-6]。

線粒體作為細胞的動力工廠,在細胞新陳代謝中起著至關重要的作用,線粒體的損傷將導致一系列細胞功能異常。由于線粒體可以調節細胞程序性死亡而不會引起任何不良的炎癥反應,是提高PDT治療效果的優良細胞器靶標[7-9]。帶離域正電荷的親脂性三苯基膦(TPP)可以選擇性地結合到帶負電的線粒體膜上,主要因為其化學結構中的3個苯基使其具有很強的親脂性,同時,磷原子上的正電荷可以離域到3個苯環上形成離域正電荷,使TPP易于滲透磷脂雙分子層,從而將TPP修飾過的納米粒子富集于線粒體[10-14]。Mou等[15]合成了一種新型的綠色二氧化鈦(G-TiO2-x),其近紅外光(920 nm)吸收強于黑色二氧化鈦(B-TiO2-x),為了降低激光功率密度和副作用,提高光動力治療效果,將TPP配體修飾到G-TiO2-x上,得到的納米粒子用于靶向線粒體的PDT和光熱的聯合治療,該納米粒子在體外和體內都表現出優異的治療效果。

此外,在用于遞送PSs的多功能納米載體中,具有多孔晶體結構的金屬有機骨架(MOF)因其具有較高的比表面積和易于調節的孔徑優勢,受到廣泛關注[16]。特別是基于Zr(Ⅳ)的卟啉金屬有機框架納米粒子PCN-224,不僅可以作為載藥的納米載體[17],而且本身也是一種具有很強滲透力的PSs[18]。

本研究合成含TPP的兩親性聚合物,通過兩親性聚合物的自組裝,將光敏劑PCN-224包封進膠束中,得到具有靶向線粒體功能的納米粒子(Scheme 1)。并通過核磁共振譜(1H NMR)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、透射電子顯微鏡(TEM)、動態光散射(DLS)、紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)、熒光光譜(FL)、電感耦合等離子體發射光譜(ICP-OES)等,表征了合成的納米粒子的理化性質;通過熒光探針2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),表征了合成的納米粒子產生ROS的能力;通過共聚焦顯微鏡(CLSM),觀察納米粒子在細胞內部的分布情況;通過細胞毒性(MTT)測試,檢測納米粒子對小鼠乳腺癌細胞的毒性。結果證明將光敏劑包封進膠束后,其產生ROS的能力明顯高于卟啉配體,且含TPP的膠束成功將光敏劑PCN-224富集于線粒體,對癌細胞的毒性大于單純的光敏劑PCN-224,為后續抗腫瘤的研究奠定了理論基礎。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450型紫外/可見分光光度計;Agilent Varian 600 MHz型核磁共振儀(TMS為內標);Bruker TENSOR27型紅外光譜儀;JEM-2100UHR型透射電子顯微鏡;Malvern Instruments Nano-ZS ZEN3600型粒度儀;Shimadzu RF-6000型分光光度計;Agilent 730型電感耦合等離子體發射光譜儀。

半胱胺鹽酸鹽、三氟乙酸乙酯、3-巰基丙酸甲酯,阿拉丁工業有限公司;5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、苯甲酸(BA),梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;聚乙二醇2000(PEG2000)、 ZrOCl28H2O, Sigma-Aldrich; 2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),上海畢得醫藥科技股份有限公司;RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS),卡爾斯巴德;活性氧檢測試劑盒、Mito-Tracker Red CMXRos(線粒體紅色熒光探針)、Hoechst 33342染色液,碧云天生物科技有限公司;其余所用試劑均為分析純或化學純。

1.2 合成

(1) 兩親性聚合物的合成

兩端具有不飽和鍵的硫代硫縮酮分子(TK)的合成：將10 g半光胺鹽酸鹽和24 mL三乙胺溶解在250 mL甲醇中,將溶液置于冰浴中,加入10 mL三氟乙酸乙酯攪拌3 h后,室溫繼續反應12 h,經萃取、洗滌后,經硅膠柱層析純化得中間產物2-巰基三氟乙酰胺。將5.7 g 2-巰基三氟乙酰胺,4.4 g的3-巰基丙酸甲酯和2 g的丙酮溶于50 mL乙腈中,冰浴冷卻,加入13 mL的三氟化硼乙醚，繼續反應2 h。反應結束后,經萃取、洗滌后利用柱層析分離得到產物,加入6 mol/L氫氧化鈉溶液使三氟乙酸酯基團脫保護,得到TK-NH2。將0.64 g的TK-NH2溶于15 mL二氯甲烷中,置于冰浴中,分別加入2.3 mL三乙胺和1.1 mL丙烯酰氯,反應5 h后,室溫繼續反應19 h,經萃取、干燥得兩端具有不飽和鍵的硫代硫縮酮分子(TK)。

將0.262 g的三苯基膦溶于20 mL無水乙腈中,升溫至100 ℃,在氮氣保護下,緩慢滴加5 mL溶解有0.195 g 6-溴己酸的乙腈,滴畢,氮氣保護下繼續反應16 h得TPP-COOH。將8.0 g的PEG2000溶于10 mL無水二氯甲烷中,置于冰浴中,氮氣保護下,加入2 mL甲基磺酰氯和2 mL三乙胺后,室溫反應24 h,經過濾、濃縮后,加入大量乙醚沉淀,減壓抽濾后,得到淡黃色固體,干燥后加入100 mL 體積分數為25%的氨水,室溫反應4 d,敞口放置3 d,用NaOH調節溶液pH至13,經萃取、干燥后,用乙醚沉淀,減壓抽濾得到固體粗產物,重復二氯甲烷溶解、乙醚沉淀、過濾操作兩遍,所得固體充分干燥后即為NH2-PEG-NH2。將2.265 g的TPP-COOH溶于40 mL無水二氯甲烷中,加入0.576 g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1.008 gN,N′-二環己基碳二亞胺(DCC),攪拌1 h,加入30 mL溶解有11.988 g NH2-PEG-NH2的無水二氯甲烷,室溫反應12 h,經濃縮、乙醚沉淀后得NH2-PEG-TPP。

將TK、 NH2-PEG-TPP、 1H-咪唑-2-胺混合于雙頸燒瓶中,在氮氣保護下,于120 ℃下反應10 h。粗品溶于適量二甲亞砜(DMSO)中,透析、冷凍干燥備用。

(2) PCN-224的合成

將100 mg TCPP、 300 mg ZrOCl2·8H2O和2.8 g BA依次溶于裝有100 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)的250 mL圓底燒瓶中,攪拌至固體溶解后,在溫度為90 ℃、轉速為300 r/min條件下,恒溫反應5 h。懸濁液通過離心分離得到的固體粒子依次用DMF和蒸餾水洗滌3次,避光保存。

(3) 膠束@PCN-224的制備

將1 mg PCN-224分散到5 mL蒸餾水中,向其中加入1 mL溶解有10 mg兩親性聚合物的DMSO,室溫攪拌12 h后,轉移到透析袋(3500)中透析48 h。透析結束后將透析液冷凍干燥備用。

1.3 性能或活性測試

(1) PCN-224穩定性測試

將PCN-224分散于水溶液中,利用動態光散射(DLS)測試其粒徑、電位,測試之后,將其放置1 d后繼續進行DLS測試,該步驟一共重復7次,從而得到PCN-224在蒸餾水中的穩定性數據。

(2) 利用DCFH-DA檢測ROS

取0.5 mg的TCPP分散到10 mL的磷酸緩沖溶液(10 mmol/L, pH=7.4, PBS)中配成50 μg/mL的樣品,取一定質量的PCN-224、膠束@PCN-224分散到PBS中配制含PCN-224質量濃度為50 μg/mL的樣品,隨后,在相同體積的樣品溶液中分別加入相同含量的DCFH-DA(10 μM)活化后的2′,7′-二氯二氫熒光素(DCFH)溶液,DCFH被ROS氧化為2′,7′-二氯熒光素(DCF)后具有熒光,在660 nm激發光(1.5 W/cm2)照射下光照2 min后,立即測得其熒光光譜,PBS作為空白對照。

(3) 細胞攝取及細胞內ROS檢測

將小鼠乳腺癌細胞(4T1)在小皿中孵育24 h,然后與PCN-224、膠束@PCN-224(光敏劑PCN-224質量濃度均為15.0 μg/mL)共孵育24 h,隨后,移除培養基,并將細胞用PBS溶液洗滌3次,加入含有10 μM DCFH-DA的無血清培養基孵育15 min后,用新鮮培養基洗滌3次,以去除多余的DCFH-DA染色液,在660 nm(20 mW/cm2)激光下光照一段時間,隨后用PBS洗滌3次,再加入含有200 nmol/L Mito-Tracker Red CMXRos的無血清培養基孵育20 min,以標記細胞內線粒體,隨后用PBS溶液洗滌細胞3次后,加入含有10 μg/mL的Hoechst 33342染色液孵育20 min,以標記細胞核,用PBS洗滌數次除去多余的染色液,用共聚焦顯微鏡掃描拍照。

(4) 細胞毒性測試

將4T1細胞以10000個/孔的數量接種到96孔板中,孵育24 h后,移除培養基,往各孔中加入100 μL含有不同質量濃度的PCN-224的納米粒子的培養基,孵育24 h后,移除培養基,重新加入新鮮培養基,用20 mW/cm2的排燈照射30 min后放入培養箱繼續孵育24 h,隨后往各孔中加入20 μL 3-(4,5)-二甲基噻唑-2-甲基-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT, 5 mg/mL),繼續孵育4 h,最后,移除培養基,往各孔中加入100 μL DMSO,用來溶解結晶的甲瓚。使用酶標儀測量各孔的光密度(OD),并計算細胞存活率。

2 結果與討論

2.1 PCN-224的表征

(1)1H NMR

合成的兩親性聚合物的核磁譜如圖1所示。從圖1中可以看出,TK鍵的甲基特征峰a(1.54), PEG的亞甲基特征峰b(3.50),咪唑環上—CH=CH—的特征峰c(6.94～6.69),以及TPP的芳香環特征峰d(7.94～7.73),由此證明兩親性聚合物已成功合成。

δ圖1 兩親性聚合物的1H NMR譜圖

(2) 粒徑分析,TEM和IR

通過溶劑熱法,合成了光敏劑PCN-224, PCN-224框架由Zr6簇和配體TCPP組成,其中,Zr具有高穩定性,配體TCPP具有對稱的分子結構,其四個羧基與Zr—O鍵進行酯化反應后形成Zr—O—C,將進一步提高PCN-224的穩定性和產生ROS效果。

通過DLS測得的結果來證明PCN-224是否具有納米級尺寸,這將有利于后續的包封實驗。如圖2所示,通過DLS測得PCN-224的水合粒徑約為100 nm,表明成功合成了具有納米級尺寸的PCN-224。如圖3a所示,通過TEM觀察到PCN-224的粒徑約為80 nm,且具有規則的類球形。DLS測得的粒徑大于TEM觀察的結果,這是因為：一方面,TEM測試的PCN-224是干燥后的,而DLS測試的水合粒徑,在制備TEM樣品時,干燥后的PCN-224會失去表面附著的水分子,導致粒徑變小;另一方面,與TEM在干燥狀態下測定的尺寸相比,水合粒徑的明顯增加,可能是由于PCN-224的表面疏水性,導致納米粒子在水溶液中的輕微聚集,從而導致水合粒徑的增加。如圖3b所示,對透射電鏡圖中PCN-224粒子進行數量統計,得到PCN-224的粒徑分布直方圖,大部分PCN-224的粒徑分布在80～90 nm。

粒徑/nm

圖3 PCN-224的透射電鏡照片和粒徑分布

通過對照有機配體TCPP、 PCN-224的FT-IR譜圖,判斷PCN-224是否成功合成。從圖4 TCPP的紅外光譜圖中可以看到,在1670～1725 cm-1存在C=O的吸收峰,而合成的PCN-224的紅外光譜圖在1700 cm-1附近無吸收峰;在1650 cm-1附近出現類似TCPP在1700 cm-1附近的羰基吸收峰。由此可知,在合成PCN-224的過程中,TCPP的羧基變成羧酸鹽,使得羰基的峰位置發生了變化;在650 cm-1處的峰是由Zr—OH鍵引起的,從而證明了PCN-224的成功合成。

ν/cm-1

(3) UV-Vis和FL

如圖5a所示,通過對PCN-224的UV-Vis光譜的分析,可以看到PCN-224在425 nm處有一個強吸收峰(Soret帶),在500～700 nm之間有4個弱吸收峰(Q帶)[19],這4個小峰的存在歸因于金屬有機框架PCN-224中存在的卟啉配體在500～700 nm之間的Q帶,而紫外可見吸收光譜反映的主要是分子中的生色團和助色團,所以Zr基金屬的加入不會引起有機配體TCPP的UV-Vis光譜發生變化。由此可知,合成的PCN-224中存在卟啉結構。熒光發射光譜測試是在某一固定波長的激發光作用下檢測PCN-224納米顆粒的熒光強度在不同波長處的分布情況。如圖5b所示,以440 nm激發波長作為激發光進行發射光譜的測試,可以觀察到PCN-224納米粒子的光致發光(PL)光譜在紅光區680 nm處出現發射峰,表明此時的熒光強度最強。卟啉有機配體TCPP具有很強的熒光性能,通過對合成的PCN-224進行熒光發射光譜的測試,進一步證明PCN-224中存在配體TCPP結構。

λ/nm

(4) PCN-224的穩定性

通過DLS測試,得到7 d內PCN-224在水溶液中的粒徑電位數據,探究PCN-224在水溶液中的穩定性。如圖6所示,可以看到7 d內用DLS測得的數據曲線波動不大。其中,PCN-224的水合粒徑均為100 nm左右,電位約為+30 mV,兩個圖中曲線的平緩程度證明合成的PCN-224在水溶液中有較好的穩定性,表明PCN-224的結構不易坍塌。

時間/d

2.2 膠束@PCN-224的表征

通過DLS測試得到PCN-224包封進膠束后的粒徑電位變化,結果見表1。由表1可知,當PCN-224包封進膠束后,納米粒子的粒徑由132.7 nm增大到136.7 nm,電勢由+13.5 mV降低到+7.04 mV。

表1 膠束、PCN-224、膠束@PCN-224的粒徑、電勢和多分散系數

通過對照PCN-224、膠束、膠束@PCN-224的FT-IR圖譜,判斷PCN-224是否成功包封進膠束中,其IR譜圖見圖7。由圖7可知,膠束本身在1400 cm-1左右沒有特征峰,而包封PCN-224后,在1403 cm-1出現了特征峰,該峰為PCN-224羧酸基團中的O—H彎曲振動峰。

通過ICP-OES測得納米粒子中包封的金屬Zr的質量為215.2 μg,以及投入的PCN-224中Zr的質量為250.3 μg,換算得到膠束@PCN-224中包封的PCN-224的質量為0.85 mg,計算得到膠束@PCN-224中PCN-224的載藥量為7.91%。

2.3 體外ROS檢測分析

相同濃度的TCPP、PCN-224、膠束、膠束@PCN-224在光照之后產生ROS的情況,如圖8所示。熒光強度越高,說明光照產生的ROS越多。PCN-224與TCPP相比較,發現由金屬Zr和TCPP合成金屬有機框架后,其產生ROS的能力大大增強,這是由于金屬有機框架的結構使得TCPP周期性地排列在陣列中,能夠有效降低激發能的猝滅;同時,框架的多孔性也有利于底物的進入[20-21]。將PCN-224與膠束@PCN-224對比,發現當PCN-224被包封進膠束后,其產生ROS的能力下降,這可能是由于膠束中所含的TK被ROS裂解,從而消耗了一部分ROS。將TCPP和膠束@PCN-224對比,可知膠束@PCN-224產生ROS的能力明顯強于TCPP,說明膠束包封了PCN-224之后仍具有較強的產生ROS的效果。

2.4 4T1細胞對納米粒子的攝取

為了研究經TPP修飾過的兩親性聚合物的線粒體靶向作用,本研究應用CLSM來評估PCN-224和膠束@PCN-224在4T1細胞中的分布情況。PDT所產生的ROS用DCFH-DA標記,線粒體用Mito-Tracker Red CMXRos染色,細胞核用Hoechst 33342染色,PCN-224因其本身能在420 nm激發光下發出約650 nm的熒光,因此不需要染料進行染色即可從共聚焦顯微鏡下觀察到PCN-224。納米粒子進入細胞后的分布如圖9所示,從圖9a中可以看到與PCN-224共孵育的4T1細胞觀察到少量的紫色熒光,且紫色與藍色標記的細胞核位置幾乎相同,而紅色熒光標記的線粒體和紫色熒光位置不同,表明PCN-224本身進入細胞的能力有限,且進入細胞后也不會主動富集于線粒體,而是會擴散到細胞核中。從圖9b中可以看到,與膠束@PCN-224共孵育的4T1細胞能觀察到明顯的紫色熒光,且與紅色熒光標記的線粒體重疊的部分較多,說明膠束@PCN-224能提高PCN-224進入細胞的能力,且在TPP的作用下,將其靶向遞送到線粒體。

圖9 納米粒子在細胞內的分布*

納米粒子進入細胞后產生的ROS分布如圖10所示,從圖10a中可以看到,綠色熒光標記的ROS與紅色熒光標記的線粒體和藍色熒光標記的細胞核都有所重疊,但綠色熒光強度太弱,說明進入細胞有限的PCN-224產生的ROS不足。從圖10b中可以看到,與膠束@PCN-224共孵育的4T1細胞能觀察到明顯的綠色熒光,且綠色熒光的位置與紫色熒光和紅色熒光標記的線粒體一致,說明膠束@PCN-224進入細胞后在TPP的作用下靶向到線粒體,且在線粒體處經光照后將產生足夠的ROS。CLSM的結果有效說明了含TPP的兩親性聚合物的線粒體靶向能力。

圖10 細胞內產生ROS的分布*

2.5 納米粒子對4T1細胞的毒性

為了進一步研究經TPP修飾過的兩親性聚合物的線粒體靶向作用,本研究應用MTT法來評估PCN-224和膠束@PCN-224對4T1細胞的毒性。由圖11可見,隨著PCN-224質量濃度的增加,在沒有光照的條件下,PCN-224、膠束@PCN-224均對4T1細胞有低的細胞毒性,而在光照條件下,PCN-224、膠束@PCN-224對4T1細胞毒性的影響都逐漸增大,且在最大藥物濃度時細胞存活率分別為32 %、29 %,將相同質量濃度下的PCN-224和膠束@PCN-224對比,可以看到后者對4T1細胞的毒性均大于前者,這一結果進一步證明了含TPP的兩親性聚合物的線粒體靶向作用,實驗結果表明所合成的納米粒子增強了PDT效果。

cPCN-224/μM

合成了具有線粒體靶向的兩親性聚合物,并通過水熱法制備得到了具有納米級尺寸的光敏劑PCN-224,隨后利用兩親性聚合物的自組裝,將PCN-224包封進膠束,得到具有線粒體靶向功能的納米粒子(載藥量7.91%)。最后,利用熒光探針DCFH-DA對ROS的特異性識別,在相同條件下測試了各體系的熒光強度,結果證明金屬有機框架PCN-224有效提高了TCPP產生ROS的效果;將其包封進膠束后,膠束@PCN-224仍具有較強的產生ROS的效果,利用CLSM、MTT測試證明了膠束具有線粒體靶向功能,能將PCN-224主動靶向至線粒體,有效增強了PDT效果。該納米體系的構建有利于提高PDT治療效果。