膜聯蛋白A1對器官缺血再灌注損傷保護作用的研究進展

張元杰，張紅

(1.遵義市第四人民醫院麻醉科，貴州 遵義 563004；2.遵義醫科大學附屬醫院麻醉科，貴州 遵義 563000)

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)是指組織或器官經過一段時間的缺血后重新恢復血供，但因組織器官生理功能未能及時恢復，而加重其功能障礙和結構損傷的一種病理狀態。IRI的發生有兩個階段：由血管阻塞所致的缺血階段和隨后的再灌注階段，表現為局部和全身的嚴重炎癥反應[1]。臨床常見于動脈搭橋、心腦肺復蘇、溶栓療法、斷肢再植及器官移植等。“缺血”是指由于動脈流入受阻而導致的組織血液供應不足，組織細胞功能障礙的嚴重程度與受梗阻的程度和持續時間有關，對器官缺血的治療主要為盡早恢復受影響器官的血流。然而，再灌注會產生大量的炎癥介質，可以誘導和加重組織損傷[2]。近年來，尋找器官IRI的保護方法成為研究熱點。目前，臨床尚未發現IRI的特效藥物和方法，原因主要為IRI機制尚不十分明確。膜聯蛋白(annexin，Anx)A1是一種天然的內源性抗炎蛋白，可干擾粒細胞的聚集、遷移和在炎癥部位的活性；參與調控炎癥反應，細胞增殖、分化和細胞信號傳遞等過程[3]，從而減輕器官IRI。現就AnxA1對器官IRI保護作用的研究進展予以綜述。

1 AnxA1

Anx是一類鈣依賴的磷脂結合蛋白超家族，其中AnxA1是最早發現的成員，也被稱為脂皮素、依鈣蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白或p35。AnxA1由中心結構域和N端結構域[4]組成。其在機體多數器官、組織中廣泛存在，在中性粒細胞、上皮細胞、單核細胞中均高表達。Ac2-26是來自于AnxA1 N端結構域的活性肽，具有AnxA1的生物學功能。近年來研究表明，AnxA1參與多種細胞的病理生理過程，包括細胞信號轉導、磷脂酶A2活性的抑制，以及宿主免疫系統中糖皮質激素抗炎反應的調節[5]。隨著研究的深入，人們發現AnxA1對機體心臟、腦、肺臟、腎臟及胃腸損傷具有一定的保護作用。

2 AnxA1對器官IRI的保護作用及機制

2.1心臟IRI 缺血性心臟病是導致死亡的主要原因，心肌缺血時，由于氧化磷酸化停止導致的ATP消耗可抑制心肌收縮功能。最初，人們認為再灌注可以限制梗死面積并維持左心室收縮功能。然而，研究證明再灌注本身可以誘導心肌細胞死亡[6]。缺血性心臟病中的再灌注導致活性白細胞，尤其是中性粒細胞和其他介質，如補體碎片、活性氧類和促炎細胞因子在缺血組織中大量流出，而這些物質會促進心肌細胞死亡和心肌進一步損傷[7]，心肌細胞IRI后，胱天蛋白酶12和胱天蛋白酶3蛋白表達增加[8-9]，而缺血導致Ca2+超載，對心肌超微結構造成損傷。

在心肌IRI小鼠模型中，AnxA1模擬肽Ac2-26不僅可以減少心肌細胞死亡，而且還可以減輕心肌壞死、炎癥、心肌纖維化和凋亡，對心肌起到潛在的保護作用[10]。其機制可能與Ac2-26減小心肌梗死面積和降低循環心肌細胞損傷標志物(肌鈣蛋白)水平，延遲心肌梗死后的內皮細胞功能障礙有關[11]。Ac2-26在心肌IRI早期有心臟保護作用，可限制、延遲早期左心室收縮功能障礙，表明Ac2-26可能是心肌IRI的標志物，可能成為缺血性心臟病治療的新靶點。Qin等[12]研究發現，內源性抗炎AnxA1在IRI后維持左心室活力和功能方面起重要作用，但其在體內的心臟保護作用機制目前尚不清楚。而Ac2-26可通過脂氧素A4/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路減輕心肌病理損傷和心肌超微結構損傷，減少膿毒癥誘導的心肌細胞凋亡，對心臟有保護作用。其主要通過上調脂氧素A4蛋白表達水平，降低PI3K和Akt蛋白表達水平，下調核因子κB活性，降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，抑制h9c2細胞胱天蛋白酶3/8的活性來實現[13]。Perretti等[14]研究發現，AnxA1衍生肽CR-AnxA12～48在缺血再灌注誘導的心臟損傷中有顯著的心肌保護作用。這種被稱為CR-AnxA12～48的肽對促分解脂蛋白A4受體具有高度的親和力和特異性，能促進凋亡中性粒細胞的有效增殖，減少中性粒細胞向活化的內皮細胞的募集，從而有效調節吞噬細胞反應。

2.2腦IRI 腦血管疾病是繼缺血性心臟病后常見的死亡原因。急性缺血性腦卒中是引起腦血管疾病最常見的原因[15-16]，其治療主要為快速再通閉塞血管，恢復血液供應，限制局部缺血損傷和全身缺氧損傷。然而，再灌注可導致分子水平和細胞水平的組織損傷，缺血可導致各種細胞介質的堆積，包括活化的白細胞(中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞)和血小板的堆積，同時缺血可激活常駐細胞(小膠質細胞、星形細胞)和超氧化物的產生，進而刺激細胞因子[TNF-α和白細胞介素(interleukin，IL)-1β]的生成[17-18]。

Gussenhoven等[19]研究發現，在未成熟的腦組織中，AnxA1可預防腦缺血后血腦屏障丟失并改善缺血缺氧后血腦屏障的完整性，對腦IRI具有保護作用。在腦血管和腦室管膜誘導缺血缺氧后24 h內內源性AnxA1缺失，在小膠質細胞中缺血缺氧72 h后AnxA1上調。其作用機制主要為AnxA1通過靶向作用于甲酰肽受體(formyl peptide receptor，FPR)發揮治療作用，而這一治療作用可被FPR抑制劑所消除[20]。Peritore等[21]研究發現，在腦IRI過程中，AnxA1模擬肽Ac2-26很大程度上控制了炎癥反應，對腦IRI有保護作用。有學者對小鼠雙側頸總動脈進行閉塞，然后再灌注，并用AnxA1模擬肽Ac2-26治療40 min，結果發現小鼠白細胞黏附減少，2 h后所有腦微血管中白細胞-內皮細胞相互作用降低；而對照小鼠聯合應用Ac2-26和FPR拮抗劑進行治療，40 min時完全消除了Ac2-26的作用，且在應用FPR拮抗劑后2 h時效果較差，這可能因為Ac2-26對L-E早期作用更明顯[22]。

Gimenes等[23]研究表明，Ac2-26通過下調炎癥介質和神經元丟失發揮腦神經保護作用。炎癥過程被認為是大腦顳葉癲癇病理生理學的一個重要機制，在毛果蕓香堿誘導的大鼠癲癇持續狀態實驗模型中，Ac2-26的全身治療降低了海馬的神經元變性和白蛋白水平[23]。另外，Ac2-26降低了星形細胞標志物膠質纖維酸性蛋白的水平，并減少IL-1β、IL-6和生長調節α蛋白的表達。可見，抗炎蛋白AnxA1是通過抑制白細胞遷移和促炎介質釋放來調節腦神經炎癥的一個重要靶點。

Park等[24]研究發現，AnxA1通過抑制RhoA-ROCK信號通路恢復了β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)1～42誘導的血腦屏障破壞，對腦有保護作用。在小鼠腦內皮細胞系彎曲處，AnxA1可減少Aβ1～42引起的血腦屏障破壞[24]。而RhoA抑制劑減輕了Aβ1～42誘導的血腦屏障破壞，RhoA-GTP(RhoA的活性形式)持續過度表達減弱了AnxA1的保護作用。Vital等[25]采用活體顯微鏡觀察發現，腦IRI伴有中性粒細胞、血小板活化，且中性粒細胞、血小板在腦微血管內聚集。而AnxA1 N端衍生肽Ac2-26可激活中性粒細胞，調節腦內中性粒細胞血小板聚集的形成，抑制腦微血管系統的反應，明顯改善缺血后大腦微循環，對腦IRI有保護作用。

2.3肺IRI 體外循環肺損傷是心外科術后常見并發癥之一，學者認為IRI可能是體外循環肺損傷的重要原因之一[26-27]，IRI可激活中性粒細胞，并在肺組織內聚集、潴留，產生炎癥“級聯瀑布”效應。而體外循環肺損傷的發生機制及尋找肺保護措施，一直是體外循環研究領域關注的熱點。

Liao等[28]研究發現，在大鼠缺血再灌注誘導的肺損傷模型中外源性Ac2-26可顯著減輕肺水腫、減少支氣管肺泡灌洗液中促炎細胞因子的生成、減輕氧化應激、減少細胞凋亡及中性粒細胞溶解，減少受損肺組織中AnxA1蛋白的表達，抑制核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶途徑，減輕缺血再灌注引起的肺損傷，對肺有保護作用。而用FPR拮抗劑Boc2處理可以消除Ac2-26的保護作用。在慢性阻塞性肺疾病誘導的動物模型中，腹腔內注射Ac2-26對慢性阻塞性肺疾病誘導的肺損傷有保護作用[29]。外源性Ac2-26可以防止支氣管肺泡灌洗液、肺部和氣管中的白細胞增多，其作用的具體機制為血漿和支氣管肺泡灌洗液中的促炎介質減少，抗炎細胞因子水平升高。IRI后，肺組織、血漿中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高[30]。其中，IL-6被認為是嚴重急性肺損傷的標志[31]。

在AnxA1誘導的肺損傷模型中，肺成纖維細胞中的IL-6、IL-8和IL-1β水平在前6 h升高，后6 h下降。當AnxA1刺激的濃度升高和持續時間增加時，AnxA1足以緩解炎癥，減輕炎癥細胞因子誘導的膠原沉積，對肺有保護作用[32]。AnxA1可提高支氣管上皮細胞的存活率，對肺損傷有保護作用。這種保護作用機制可能通過上調PI3K/Akt信號通路實現。同時，AnxA1通過減少活性氧類的產生，調節超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛和乳酸脫氫酶的活性，可以減輕苯并芘誘導的氧化應激。

此外，AnxA1通過減少Bcl-2的表達，以及增加Bcl-2相關X蛋白和細胞周期蛋白D1的表達，減少細胞凋亡，從而起到肺保護作用[33]。腸IRI也是急性肺損傷發生的主要原因，而用外源性Ac2-26治療可以減少肺血管滲漏，降低腸道IRI后肺組織中性粒細胞和髓過氧化物酶水平，這可能由于Ac2-26可以減少促炎細胞因子TNF-α的產生，并促進抗炎細胞因子IL-10的釋放，從而起到肺保護作用[34]。

2.4腎IRI 腎移植是引起腎IRI的主要原因。由于先天性和適應性免疫反應的激活，移植腎在再灌注階段會發生更嚴重的損傷，許多接受腎移植患者正在接受免疫抑制治療，以預防移植功能障礙。環孢菌素是一種免疫抑制劑，用于避免器官移植排斥反應。環孢菌素治療的主要副作用為腎毒性，其可降低腎血流量，增加腎血管阻力，從而使腎發生IRI[35]。

研究發現，Ac2-26外源性給藥可以逆轉腎毒性，對腎有保護作用[36]。腎IRI的特征為腎小球濾過率(即單位時間內兩腎生成濾液的量)降低。缺血導致ATP的消耗，進而抑制腎小管Na+，K+-ATP酶的活性和Na+/H+交換器的再分布[36]。這兩種情況均會導致管狀細胞對Na+的再吸收減少。由于Na+濾過增加，Na+通過腎小管負反饋調節機制限制了腎小球濾過率，以避免Na+和水的流失[37]。腎IRI后腎功能受損，血肌酐、血尿素氮升高，腎臟小管上皮細胞脫落死亡[38]。Facio等[39]研究發現，在大鼠腎IRI模型中，給予外源性AnxA1模擬肽Ac2-26可減少腎小管壞死、吞噬細胞(包括中性粒細胞和單核細胞)的流入、Na+和K+排泄以及降低腎小球濾過率，從而對腎臟起保護作用。

糖尿病是一種代謝綜合征，影響許多器官(包括腎臟)，30%～40%的糖尿病患者出現腎病[40]。Purvis等[41]研究發現，AnxA1可通過減少p38、胞外信號調節激酶和c-Jun氨基端激酶的磷酸化，激活Akt信號通路從而減輕糖尿病小鼠微血管并發癥，對腎損傷有保護作用，這表明AnxA1可能是治療腎功能不全的潛在策略。

2.5胃腸IRI 胃腸道系統的IRI主要見于腹部和胸部血管手術，也可能與小腸移植和出血性休克有關。大多數胃腸道并發癥導致腸系膜缺血和IRI。其中，與腸系膜IRI相關的死亡率為40%～60%[42]。炎癥是腸道IRI的重要因素。腸道IRI通過核因子κB激活局部炎癥反應，誘導炎癥細胞因子(如細胞因子、細胞間黏附分子)和趨化因子受體的產生。IRI導致白細胞的募集和滲透，造成組織損傷[43]。同時，缺血的腸黏膜也會產生大量不同的炎癥細胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL-12、IL-15和IL-23，它們可以顯著增加白細胞浸潤，加劇炎癥和損傷[44]。

研究發現，在小鼠腸系膜IRI模型中，靜脈注射Ac2-26可抑制白細胞黏附和遷移，對腸系膜IRI有保護作用[45]。上皮細胞屏障的喪失是腸IRI的主要特征，但目前關于AnxA1對腸IRI模型中上皮細胞屏障影響的研究較少。研究顯示，AnxA1在胃腸道炎癥小鼠模型(包括結腸炎和胃潰瘍)中起保護作用[46]。另有研究表明，Ac2-26可促進胃黏膜損傷的愈合，減小潰瘍面積，對胃有保護作用。Leoni等[47]研究發現，當使用聚合物納米粒在腸道局部輸送Ac2-26時，可以增強結腸炎的上皮細胞修復，對腸有保護作用。在活檢誘導的腸IRI模型中，將外源性AnxA1模擬肽Ac2-26封裝在靶向聚合物納米粒(Ac2-26 Col Ⅳ NP)內，局部腸道輸送加速了小鼠結腸損傷的愈合[47]。此外，Ac2-26 Col Ⅳ NP一次全身給藥可加速實驗性結腸炎后的恢復。

AnxA1在腸道切口愈合中依賴于FPR1/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，Nox1)的作用[48]，AnxA1與FPR1結合后，激活SRC和下游Nox1，由Nox1產生的活性氧類導致人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和ptp-pest的快速可逆性氧化，隨后迅速失活。這種失活的磷酸酶參與細胞運動，并導致Fax和Paxillin的局灶性黏附蛋白活化，從而增加上皮細胞運動和切口修復，對腸道有保護作用[49]。在右旋糖酐硫酸鈉誘導的結腸炎模型中，學者發現AnxA1可以通過與FPR受體結合來調節腸道黏膜損傷和炎癥反應，對腸道有保護作用。

3 小 結

近年來，尋找器官IRI的保護措施是研究的熱點。AnxA1作為鈣依賴的磷脂結合蛋白，目前已被證明對多種器官IRI有一定的保護作用。AnxA1可干擾粒細胞的聚集、遷移和在炎癥部位的活性，通過減輕炎癥反應，抑制細胞凋亡，減少器官缺血后再灌注組織損傷，對器官起到保護作用，有廣闊的應用前景。但AnxA1對器官IRI方面的保護作用機制有待深入研究和闡明。且目前對AnxA1的研究多停留于動物實驗，在臨床的推廣使用需進一步驗證。未來，期望AnxA1的藥理學研究會有新進展，并將其應用于器官IRI的臨床靶向治療。