奶牛乳腺炎細胞模型的建立及中藥治療作用機制研究進展

申紀饒，武小虎，張惠婷，李新圃，丁學智，嚴作廷，李宏勝

（中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所／農業部 獸用藥物創制重點實驗室／甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050）

奶牛乳腺炎是一種由機體、病原微生物和環境衛生共同作用引起的奶牛常見病，發生范圍廣、發病率高，嚴重影響奶業的可持續發展［1］。全世界約有三分之一的奶牛患有各種類型的乳腺炎，而我國臨床型乳腺炎發病率高達33.41%，隱性乳腺炎陽性率更高達46.4%～85.7%，均高于國外，給我國奶牛養殖業帶來了巨大的經濟損失［2］。

目前，獸醫臨床上主要采用抗生素防治奶牛乳腺炎，但抗生素的使用導致乳汁中的抗生素殘留和病原菌耐藥問題加劇，不僅危害了奶牛的健康，同時也影響了人們對綠色食品的追求［3］。中藥以純天然、資源豐富、低毒、低殘留、藥效明確、不易產生耐藥性、綠色環保等優勢，成為未來研究防治奶牛乳腺炎藥物的發展方向［4］。

中藥方劑的篩選及作用機制的研究通常需要建立相關的疾病模型，使用奶牛活體研究開發新藥具有成本大、風險高且無法保證試驗樣本同一性的問題。而牛乳腺上皮細胞（bMEC）作為乳腺中唯一具有分泌功能的細胞，不僅是實現泌乳的基礎，而且是通過乳導管與外界接觸較緊密且具有免疫功能的細胞，是乳腺先天免疫的重要組成部分，與奶牛乳腺炎的發生有著密切聯系。bMEC廣泛分布在高度分支的乳腺實質組織表面，其數量遠多于其他參與抵御侵入病原菌的免疫細胞，在乳腺免疫中扮演重要角色，可以成為乳腺免疫的哨兵，它的免疫功能也因此受到人們的極大關注［5］。研究表明，bMEC可以表達多種細菌傳感器，即病原菌模式識別受體，可以識別病原體相關分子模式，進而產生免疫應答，釋放IL-8、IL-1β、IL-6、TNFα、IL-17A等炎癥介質，進行免疫防御［6-7］。由于bMEC的免疫特性，目前它已經廣泛用于生理、病理、藥理等方面的研究，以及研究泌乳機制、乳腺炎發病機制和藥物篩選等，為奶牛乳腺炎的研究節約了成本、提高了效率。因此，文章就中藥防治奶牛乳腺炎的研究現狀、體外乳腺炎細胞模型的建立、中藥干預奶牛乳腺炎細胞模型研究進展及其作用靶點進行綜述，以期為奶牛乳腺炎的臨床防治找到一種有效的解決措施。

1 乳腺上皮細胞的培養特性研究

從尊重生命和動物福利考慮，在藥物研究初期應盡量減少實驗動物和靶動物的使用；同時也為了避免體內試驗周期長、成本高、條件復雜且存在個體差異等諸多問題，細胞試驗成了研究者的首選。因此，建立乳腺上皮細胞體外分離培養體系是開展乳房炎致病機制研究及治療藥物篩選工作的基礎。

1.1 小鼠乳腺上皮細胞

劉玉輝等［8］通過采取妊娠后期的健康SPF昆明鼠的乳腺組織，經膠原酶消化等一系列操作后成功分離到高濃度的小鼠乳腺上皮細胞，其形態呈鋪路石樣，細胞聯系緊密，間隙清晰。高云航等［9］采取孕中期的健康小鼠，選用混合酶經差時消化法及傳代培養、分離、純化到鋪路石樣的乳腺上皮細胞，當細胞密度高時呈島嶼狀生長，密度低時各細胞的凸起和細胞外基質形成拉網狀結果。易瓊等［10］利用改良過的混合酶（采用Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶混合（1∶1∶1））及差速貼壁法純化培養乳腺上皮細胞，72 h后細胞完全鋪開，呈典型的鋪路石樣。免疫熒光鑒定結果顯示，角蛋白18呈陽性反應。方彧聃等［11］利用慢病毒載體，建立了穩定表達牛催乳素的小鼠乳腺上皮細胞系，為體外研究乳腺生物反應器提供了良好的細胞模型。劉玉輝等［8］培養的傳代小鼠上皮細胞雖出現鋪路石樣外觀，但細胞間隙大，排列不規則。

1.2 牛乳腺上皮細胞

利用牛乳腺上皮細胞進行奶牛乳房炎的體外研究試驗更具可靠性。目前關于牛乳腺上皮細胞的獲取有分離原代細胞和建立細胞系兩種方式。

盧金霞等［12］采用組織塊培養法和乳汁分離法分離培養奶牛乳腺上皮細胞，利用差時胰酶消化法純化奶牛乳腺上皮細胞，通過測細胞核型及骨架蛋白-角蛋白，對分離的牛乳腺上皮細胞進行驗證。結果在顯微鏡下觀察可見，純化的乳腺上皮細胞為典型上皮細胞形態，呈多角形或乳滴形，細胞核型正常，細胞特異性蛋白-角蛋白表達呈陽性，成功建立了奶牛乳腺上皮細胞模型。馬鵬睿［13］應用組織塊種植法和胰酶消化法分離培養牛乳腺上皮細胞，鑒定為牛乳腺上皮細胞，為后續黏附素ClfA、EfB及FnBPA的抗體對金黃色葡萄球菌黏附牛乳腺上皮細胞的抑制試驗建立了基礎。董海龍等［14］通過組織貼塊法取部分奶牛乳腺組織進行培養，通過免疫熒光鑒定、形態學觀察、掃描電鏡和透射電鏡檢測原代乳腺上皮細胞特性，結果顯示，分離到的牛乳腺上皮細胞呈鵝卵石樣，呈單層聚集，細胞狀態良好，培養至15代以上細胞增殖仍旺盛，可以作為奶牛乳腺相關研究重要工具。李勝利等［15］建立了一種單層致密奶牛乳腺上皮細胞的培養方法，通過該方法，細胞能形成橋粒和緊密連接，為多種與奶牛乳腺相關的試驗研究提供了體外細胞模型。

隨著目前研究的深入，學者們不僅使用原代細胞進行研究，還旨在建立永生化的牛乳腺上皮細胞系。最常用的永生化方法包括病毒法、人端粒酶催化亞基法、引入癌基因或通過放射因素干擾細胞的衰老進程，損害其衰老機制，最終使細胞獲得永生能力［16］。B.Zavizion等［17］利用SV40LTA轉染至原代牛乳腺上皮細胞，從而建立了細胞系。這種細胞系表現出典型的上皮細胞特征，能穩定表達角蛋白、微絨毛、特殊乳白蛋白等。胡菡［18］通過一種攜帶SV40大T抗原基因的病毒感染原代牛乳腺上皮細胞，使其永生化，這種細胞能夠穩定傳代到50代并具有上皮細胞標志特征。He X.Y.等［19］通過重組腺病毒介導的人端粒酶逆轉錄酶基因建立了一種自發永生化的牛乳腺上皮細胞系，該細胞與原代細胞有同樣的基本特征。這些細胞系的建立為奶牛乳腺炎的研究提供了堅實的基礎。

2 牛乳腺上皮細胞炎癥模型的建立

體外建立乳腺炎細胞模型不僅是研究細菌感染乳腺炎的基礎，還可利用此模型進行藥物篩選。病原微生物對細菌的感染主要分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌的主要成分，可被Toll-4受體識別，而脂磷壁酸（LTA）是革蘭氏陽性菌致病的主要成分，可被Toll-2受體識別，二者均可誘導乳腺上皮細胞模擬細菌感染。因此，分別對細菌及LPS和LTA誘導乳腺上皮細胞建立炎癥模型進行綜述。

2.1 革蘭氏陰性菌誘導

LPS是革蘭氏陰性菌的主要成分，可以模擬革蘭氏陰性菌感染。利用LPS誘導小鼠乳腺上皮細胞建立模型，具有方便易得、價格低廉的優點，有助于深入研究該病的發病機制。郝俊芳等［20］以1，5，10μg／mL LPS處理小鼠乳腺上皮細胞48 h，結果顯示，與空白對照相比，LPS刺激后小鼠乳腺上皮細胞與炎癥相關的mRNA表達均呈現增加趨勢，并表現出明顯的劑量依賴性。Xiao H.B.等［21］用LPS處理小鼠及離體乳腺上皮細胞后發現，脂多糖在小鼠乳腺炎體內外模型中誘導炎癥反應，并提示NF-κB通路和OPN參與其中。在利用山羊乳腺上皮細胞建立模型方面也有文獻報道。O.B.Javier等［22］用1μg／mL LPS侵染山羊乳腺上皮細胞，結果CCL2、CXCL6、IL6、CXCL8、PTGS2、IFIT3、MYD88、NFKB1和TLR4的表達增加，該研究結果使人們對LPS刺激損害山羊乳腺組織的潛在機制有了一個基本的認識。

由于利用奶牛乳腺上皮細胞具有同源性，更受到學者們的認可。張文耀等［23］利用LPS對奶牛乳腺上皮細胞進行侵染，選用TNF-α作為建立乳腺炎細胞模型的指標，設置LPS濃度梯度0，5，10，20 ng／μL以確定最適濃度，然后根據推薦處理時間設置0，3，6 h，篩選最適濃度下能夠明顯上調TNF-α的最短處理時間作為建立模型的處理時間。結果顯示，在0～10 ng／μL濃度范圍內，LPS作用乳腺上皮細胞3 h，TNF-α基因表達水平和蛋白表達水平隨LPS處理濃度的增高而增加。安東等［24］利用0，1，10，100μg／mL LPS分別處理細胞6，12，24 h后收集細胞，檢測TNF-α的表達量。結果顯示，LPS處理后TNF-α、IL-6、BNBD-5表達量增加，確定炎癥模型建立成功。

由于大腸桿菌是目前引起奶牛乳腺炎的最主要革蘭氏陰性菌，因此，為了更加真實地建立乳腺炎細胞模型，目前大多數學者還以大腸桿菌為研究對象。盧勁曄等［25］利用大腸桿菌侵染小鼠乳腺上皮細胞，大腸桿菌刺激原代培養的乳腺上皮細胞后TLR-4和MyD88蛋白表達顯著升高，乳腺上皮細胞中促炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β的表達及活性氧（ROS）的釋放均顯著升高，成功建立了細胞炎癥模型。于亞娟等［26］用熱滅活的大腸桿菌作用于牛乳腺上皮細胞，發現大腸桿菌能促進TLR2和TLR4 mRNA和蛋白的表達，其表達水平具有劑量和時間依賴性。Gu N.J.等［27］用熱滅活的大腸桿菌（E.coli）感染原代牛乳腺上皮細胞時，發現幾乎所有編碼炎癥趨化因子相關基因被顯著激活，其中包括白細胞介素、β-防御素、血清淀粉樣蛋白A和觸珠蛋白相關的基因。

2.2 革蘭氏陽性菌誘導的乳腺上皮細胞炎癥模型

LTA是革蘭氏陽性菌細胞壁的重要成分，能激發機體的炎癥反應［28］。利用LTA刺激乳腺上皮細胞建立炎癥模型，可以模擬革蘭氏陽性菌感染，有利于深入研究革蘭氏陽性菌在奶牛乳腺炎中的致病機制。

張文耀等［23］以0，1，10，20，40 ng／μL濃度梯度、以0，3，6，12，24 h時間梯度處理細胞，結果表明，20 ng／μL的LTA處理上皮細胞12 h可誘導乳腺上皮細胞發生明顯的細胞免疫應答，為體外建立LTA誘導奶牛乳腺炎細胞模型的最適條件。Y.Strandberg等［29］用LTA誘導牛乳腺上皮細胞，發現IL-1β、IL-8、TNF-α、CXCL6和β-防御素mRNA表達顯著增加，TLR2通路被激活。Wu Y.等［30］和A.A.I.Arbab等［31］在其研究中也有類似觀點。

在革蘭氏陽性菌方面，目前研究最多而且比較成功的主要是金黃色葡萄球菌，該菌是引發奶牛乳腺炎最常見的病原微生物之一，目前的大多數研究也以此為出發點進行深入研究。H.Lahouassa等［32］將金黃色葡萄球菌與乳腺上皮細胞共培養，在感染后3，10，24 h測定相關炎性因子的表達。結果發現，與未感染的乳腺上皮細胞相比，感染3 h后的細胞表達了更多的IL-1β、TNF-α、IL-8和GRO-α等炎癥因子。崔新潔等［33］用金黃色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮細胞，發現能刺激細胞表達IL-1β及TNF-α。趙凌等［34］發現，不同濃度純化的金黃色葡萄球菌液感染牛乳腺上皮細胞后，細胞因子表達呈上升趨勢，其受體表達呈下降趨勢，并誘導細胞出現凋亡現象。該試驗利用金黃色葡萄球菌進行體外感染試驗，為因革蘭氏陽性菌感染而導致乳腺炎的致病機制提供了科學依據。

3 中藥防治奶牛乳腺炎的研究現狀

中藥的藥理作用眾多，兼具抗病毒［35］、抗菌感染［36］。抗腫瘤和提高免疫力［37］等多種藥理作用。中藥能夠減小炎癥對機體的損傷，阻礙炎癥的發生發展，對炎性介質的分泌具有重要影響。在奶牛疾病臨床上，不同劑型的多種中藥配方用于治療奶牛乳腺炎取得了顯著的效果［38］。

朱永平［39］利用金銀花、紫花地丁、蒲公英等制成中藥方劑對患乳腺炎的116頭奶牛進行治療，其中治愈99例，好轉12例，有效率達95.7%，且產奶量提高了9.2%。白冬冬等［40］用地膚子、蒲公英等制備的地膚通乳散治療奶牛乳腺炎，通過臨床試驗進行療效觀察，結果顯示，地膚通乳散對奶牛乳腺炎的治愈率和有效率分別高達63.16%和89.47%。范才良等［41］制備的一種內服中藥蒲金散對奶牛乳腺炎的治療具有良好效果，同時兼具提高產奶量的作用。據報道，利用中藥和西藥對患乳腺炎奶牛進行對比治療研究發現，中藥治療總有效率高于抗生素治療［1］。不同劑型的中藥對奶牛乳腺炎的防治也顯示出良好的治療效果，例如透皮劑［42］、軟膏劑［43］和灌注劑［44］等。

4 中藥干預奶牛乳腺炎細胞模型及其作用靶點研究進展

中藥會破壞細菌的細胞壁和細胞膜，還能使細菌的代謝活動紊亂，從而起到殺菌作用。中藥具有顯著的抗炎作用，對臨床型乳腺炎和隱形乳腺炎的防治提供了科學依據。目前的研究表明，中藥干預奶牛乳腺炎細胞模型，主要是通過抑制NF-κB信號通路活化，降低下游炎性因子的表達來實現。

Liang D.J.等［45］研究百里香酚對LPS刺激小鼠乳腺上皮細胞的抗炎作用，結果表明，百里香酚能明顯抑制LPS刺激的小鼠乳腺上皮細胞中TNF-α和IL-6的生成，iNOS和COX-2的表達也隨百里香酚劑量的增多而下降；此外，百里香酚阻斷了LPS刺激的mMECs中IκBα、NF-κBp65、ERK、JNK和p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化。說明百里香酚通過干擾NF-κB和MAPK信號通路的激活，在LPS刺激的乳腺上皮細胞中發揮抗炎作用。Liu M.J.等［46］驗證咖啡酸對LPS誘導的原代牛乳腺上皮細胞炎癥反應的抗炎特性，并闡明可能的潛在機制，結果表明，咖啡酸對LPS誘導的bMEC炎癥損傷的保護作用是通過減少NF-κB途徑中NF-α降解和p65磷酸化介導的促炎性細胞因子的產生而得以實現。Yang W.H.等［47］研究了黃芩苷對LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎癥損傷的保護機制，結果發現，LPS誘導奶牛乳腺上皮細胞發生炎癥反應，細胞活力下降，p-p65／p65和p-IκBα／IκBα比值上升，TNF-α和IL-1β的表達增加，而用黃芩苷處理后能抑制NF-κB的激活和HSP7上調，減輕LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞的炎癥和凋亡。Wang J.J.等［48］研究了桑色素對脂多糖刺激原代牛乳腺上皮細胞的抗炎作用，結果發現，桑色素以劑量依賴性的方式抑制LPS刺激的牛乳腺上皮細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的基因表達，得出桑色素對LPS誘導的牛乳腺上皮細胞炎癥反應的保護作用可能與其抑制NF-κB／MAPK信號通路有關。S.Kang等［49］為確定植物皂苷是否能減輕LPS誘導的乳腺上皮細胞炎癥反應程度，先用植物皂苷預處理細胞，然后再用LPS處理，結果發現減弱了LPS誘導的NF-κB活化和超氧物的產生，下調了環氧合酶2（COX-2）的表達。

除此之外，Miao J.F.等［50］探討了牛磺酸對脂多糖（LPS）誘導的小鼠乳腺上皮細胞功能損害的保護和抗炎作用，他們發現牛磺酸可明顯抑制LPS誘導的NAGase活性、NO濃度升高及TNF-α、IL-1β、IL-6和LF水平的升高，45 mmol／L牛磺酸顯著增加了LPS誘導的功能失調的β-酪蛋白分泌。結果表明，牛磺酸可顯著抑制LPS誘導的炎癥因子釋放，增加乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白，為牛磺酸對LPS誘導的乳腺上皮細胞功能障礙的保護作用提供了可能的解釋。

目前國內外對中藥作用LPS誘導的乳腺上皮細胞模型的研究較為廣泛，但是對于中藥作用LTA誘導的細胞模型相關報道還較為稀缺。孫靜等［51］用40μg／mL LTA處理乳腺上皮細胞24 h后建立了炎癥損傷模型，并從10味中藥中篩選到5種對奶牛乳腺炎致病菌具有較好抑制作用的中藥，組成配方作用于炎性細胞。結果發現該組方對炎性損傷具有一定保護作用，對促炎性因子基因的表達產生抑制作用。此外，還有一些研究直接針對由金黃色葡萄球菌刺激牛乳腺上皮細胞引起的細胞炎癥。Wang K.等［52］的研究表明，中國蜂膠可以防止由金黃色葡萄球菌引起的牛乳腺上皮細胞活力受損，下調細胞炎癥因子（IL-1β、TNF-α）的表達。Zhang J.L.等［53］發現，連翹苷A可以干擾由金黃色葡萄球菌引起的NF-κB和MAPKs信號通路的激活，在金黃色葡萄球菌刺激的牛乳腺上皮細胞中具有抗炎作用。

5 前景及展望

由于奶牛乳腺的特殊生理結構，易受病原微生物的入侵而發生炎癥，細菌侵入乳腺上皮細胞是建立乳腺內感染的重要一步［22］。隨著抗生素耐藥性逐年增加，以及抗生素難以進入細胞體內，導致其對病原菌導致的奶牛乳房炎治療效果降低，使得乳腺炎反復發作，難以根治［54］。中草藥含有多種生物有效成分，對奶牛疾病預防和治療效果良好，不良反應小，幾乎無殘留、無抗藥性、對乳制品無副作用，作為奶牛乳腺炎的治療藥物克服了抗生素的某些不足，在防治奶牛乳腺炎方面具有獨特的優勢。目前，通過中藥治療主要通過TLR2／4與NF-κB信號通路降低炎性因子的表達。NF-κB是真核細胞轉錄因子Rel家族成員之一，是信號傳導通路的聚集點，在調節炎癥和對外來刺激免疫應答方面起著重要作用，NF-κB被激活后進入細胞核內與靶基因上的特定位點結合，發揮轉錄調控作用，從而導致大量具有致熱活性炎性因子的合成和釋放，主要有TNF-α、IL-1β、IL-6等。中藥對乳腺上皮細胞作用抑制TLR2／4與NF-κB通路的激活，從而抑制炎癥因子的表達，由此增加細胞活力，抵御病原微生物對奶牛乳腺的侵襲，達到防治奶牛乳腺炎的目的。目前的研究主要集中于單種中藥成分對乳腺上皮細胞的作用，對中藥組方的研究還比較罕見，對未來利用中藥組方防治奶牛乳腺炎、相互配伍取得更好療效值得期待。