分子生物學技術應用于病原微生物檢測中的價值分析

鄭曉華 董銳 白晶 趙宇

（黑龍江省疾病預防控制中心，黑龍江 哈爾濱，150030）

1.病原微生物檢測中的常見分子生物學技術

聚合酶鏈反應(PCR)在生命科學領域中具有廣泛的應用價值，它是一種常見的分子生物學技術。它能在體外以體外酶的作用，促進DNA片段的合成，在合成之后，通過DNA雙鏈的延伸，退火變性等一系列的流程，然后是DNA片段，得到快速擴張，擴增之后能達到更好的檢測效果，PCR技術簡而言之，就是利用DNA片段在高溫環(huán)境下會變性，恢復常溫會再次形成雙鏈的特點，進行檢測的技術在體外95攝氏度的溫度下變成單鏈，在60度左右的溫度下，又會根據(jù)堿基互補的原理形成雙鏈，75攝氏度的環(huán)境下是DNA聚合酶的最佳溫度，在DNA聚合酶的作用下，它能沿著磷酸的方向轉(zhuǎn)為戊糖(5’-3’)[1]。聚合酶鏈反應儀實際上是一種溫控設備，可以很好地將溫度控制在95℃、55℃和72℃之間。熒光定量聚合酶鏈反應儀有單通道、雙通道和多通道，因為單通道一次只能檢測一個目標基因的擴增量，需要多次擴增才能檢測不同目標基因片段的量。它廣泛應用于醫(yī)學和生物實驗室，在類似于遺傳病圖譜檢測傳染病的診斷與檢測基因復制以及親子鑒定等方面，PCR技術都有非常廣泛的應用，在病原微生物檢測中，PCR技術更是成為當下最流行的一種檢測技術。

2.PCR技術在病原微生物檢測中的作用分析

2.1 研究方法

選取在我院就診的50例患者作為研究對象。首先選擇模擬樣本或已知數(shù)量值的臨床樣本進行多次稀釋，每個濃度至少重復三次，這樣就能獲得最低濃度的陽性檢測樣本，然后繪制標準曲線，獲得R^2和擴增效率的信息(一般標準曲線至少要有5個點，qPCR的r^2≥0.99，擴增效率為90%-110%)。然后，在最低檢測濃度附近制備幾個濃度，并進行20次重復。該方法的靈敏度/最小檢測限為19個以上陽性檢測的濃度。每名患者要采集兩份病原微生物檢測樣本，一號病原微生物檢測樣本是實驗組，它采用常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄PCR技術檢驗二號病原微生物為實驗組，它采用實時熒光定量PCR技術進行檢測，通過兩組的對照與統(tǒng)計，能夠比較出兩組患者在病原微生物檢測中具體的滿意度和陽性率。

2.2 研究過程

在無菌環(huán)境下，將20種標準菌株接種于相應的培養(yǎng)板上，在合適的溫度下培養(yǎng)12-24小時。選擇單個菌落，接種在5ml液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。生物信息學方法用于篩選基因序列的保守片段。每種病原體設計有兩對引物，共有特異性引物，40對特異性整體片段長度在90 bp到100 bp之間，在實際的檢測中，每對引物對目標的菌株基因組模板進行首次PCR，PCR之后的產(chǎn)物，經(jīng)過電泳檢測，一般是在瓊脂糖凝膠檢測所擴增的產(chǎn)物送到第三方檢測機構，然后進行DNA測序檢驗PCR引物的敏感性，整體上目標菌株的特異性引物用以擴增，引物的特異性通過聚合酶鏈反應產(chǎn)物中非特異性條帶的存在來驗證。根據(jù)模板混合物中包含的目標，選擇兩對相應的引物在與陽性對照相同的條件下進行聚合酶鏈反應，以確認聚合酶鏈反應是否可以正常進行。通過聚合酶鏈反應從目標細菌的基因組中獲得目標擴增片段。5μl模板用于多重PCR擴增，每個梯度重復3組[2]。

2.3 研究結果

與兩組患者的病原微生物檢測陽性計算率相比，在實驗組患者的病原微生物檢測整體的陽性概率為78%，這一數(shù)據(jù)與實驗組相比明顯更高一些，而兩組患者的病原微生物檢測滿意程度顯然是實驗組二更高，實驗組二的滿意率為94%，而實驗組的滿意率僅為78%。

與傳統(tǒng)的檢測方法相比，PCR有三個優(yōu)點:首先，這種方式的操作相對簡單，檢測微生物時只需1-2小時即可完成檢測，它非常適合于快速檢測，且能提升整體的病原微生物檢測效率，在突發(fā)傳染性疾病檢測中具有優(yōu)勢檢測作用，另外PCR技術的特異性很高，在檢測病原微生物時可以準確地檢測微生物的種類。最后，靈敏度高，可以達到3個rfu的靈敏度，因此在檢測病原微生物中作用是非常明顯的，在2020年新冠肺炎期間，PCR技術更是在核酸檢測中廣泛應用，新冠病毒的結構是由DNA或RNA與外部脂質(zhì)保護囊結合而成。PCR核酸檢測是直接從鼻腔取樣檢測新冠病毒的DNA。因此，直接檢測病毒DNA是最準確、最快、最有效的新冠檢測方法。經(jīng)過多年的研究，PCR技術在豬病相關的疾病診斷和檢驗中已經(jīng)具有很高的特異性，且操作方便，易于臨床開展，最大程度上節(jié)省救治時間，降低救治風險。

3.結語

總而言之，微生物病原體檢測中需要技術支持，在實際的應用過程中，PCR技術是常見的且具有較高的應用優(yōu)勢，基于此，更應當加強技術做好相關的規(guī)范，才能提升研究效果。