Notch信號通路在肝纖維化中的研究進展

張望，萬義鵬，朱萱

肝纖維化是各種慢性損傷因素（如病毒、乙醇、膽汁淤積等）刺激肝臟后引起細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積和纖維瘢痕形成的一種病理過程［1］。肌成纖維細胞是肝纖維化發生過程中ECM的主要來源，持續進展的肝纖維化可演變為肝硬化，甚至肝癌，嚴重威脅人類健康。肝纖維化本質是肝臟的一種修復反應，大量研究已表明肝纖維化是可逆的［1-3］。肝纖維化發病機制非常復雜，眾多信號通路參與其發生發展，如轉化生長因子β（TGF-β）/Smad信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路、Wnt/β-連環蛋白信號通路、Hedgehog 信號通路和 Notch 信號通路等［4］。其中，Notch 信號通路在肝纖維化的發病過程中起重要作用，抑制Notch信號通路能明顯減少肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化，抑制肝纖維化發生。本文就Notch信號通路在肝纖維化中的研究進展作一綜述。

1 Notch信號通路概述

Notch 信號通路是一個進化上高度保守的信號通路，Notch 突變體最早在果蠅中被發現，因其突變會導致果蠅翅膀發生缺刻而得名。隨著研究的深入，目前發現大多數多細胞生物存在Notch 信號通路，其通過介導細胞間相互作用與組織器官發育、穩態維持和多種肝臟疾病的發生密切相關［5］。

1.1 Notch 信號通路的組成與結構 Notch 信號通路由Notch 受體、配體和DNA 結合蛋白組成。在哺乳動物中，目前已發現Notch 信號通路有4 個受體（Notch1～4）和 5 個經典配體［Delta-like（DLL）1、DLL3、DLL4、Jagged（JAG）1 和 JAG2］［6］。Notch 受體是單次跨膜異二聚體，由Notch 細胞外結構域、跨膜區和Notch細胞內結構域（NICD）3部分組成。Notch細胞外結構域包含29～36 個串聯的表皮生長因子（EGF）樣重復序列和1個負性調控區域（NRR），EGF樣重復序列為受體與配體結合所必需，在沒有配體的情況下，NRR 在阻止受體激活方面起到關鍵性作用［7］。NICD 包含一些核定位序列、1 個反式激活區和1個富含脯氨酸（P）-谷氨酸（E）-絲氨酸（S）-蘇氨酸（T）的PEST 序列，PEST 序列與NICD 的穩定性相關［8］。經典的Notch 配體同受體類似，也是跨膜蛋白，其細胞外結構域包括多個串聯的EGF 樣重復序列、Delta-Serrate-LAG2（DSL）結構域和氨基末端（NT）結構域，串聯的EGF樣重復序列能夠增強配體與受體的親和力，DSL結構域和NT結構域為配體與受體結合并激活Notch信號所必需［9］。

1.2 Notch 信號通路的活化 在經典Notch 信號通路中，Notch 受體前體在內質網中合成后，經高爾基體中的Furin樣蛋白轉化酶在S1酶切位點處酶切后形成異二聚體形式的成熟Notch受體，然后轉運至細胞膜形成單次跨膜的異二聚體Notch 受體［10］。當Notch 受體與相鄰細胞的Notch 配體結合后，受體與配體相互作用誘導Notch 受體構象改變，導致Notch受體細胞外結構域中的去整合素金屬蛋白酶（ADAM）酶切位點（S2 酶切位點）暴露，經過ADAM酶切后，γ 分泌酶復合物在跨膜區的S3 酶切位點處進一步酶切截斷的Notch 受體，隨后NICD 釋放進入胞質，轉移至細胞核同DNA結合蛋白C-啟動子結合因子1/hairless 抑制因子/Lag-1（C-promoter binding factor 1/Suppresor of hairless/Lag-1，CSL）結合。當缺乏NICD時，CSL作為轉錄抑制因子與一系列共抑制因子如視黃醇和甲狀腺激素受體的沉默介質（SMRT）、CBF1 相互作用共抑制因子（CIR）、SKI 相互作用蛋白（SKIP）等結合導致轉錄抑制，當NICD與CSL結合后，CSL轉變為轉錄激活因子并募集共激活因子（MAML）形成NICD/CSL/MAML 轉錄復合物，進而啟動下游靶基因如Hes、Hey 等的轉錄與表達［11］。Notch 受體與相鄰細胞的Notch 配體結合后活化Notch信號，此即反式相互作用；Notch受體也可與同一細胞表面的Notch配體結合，但產生的效應是抑制Notch 信號，此為順式相互作用；反式相互作用和順式相互作用對決定細胞是信號接收細胞還是信號發送細胞十分重要［9］。

除經典Notch信號通路激活途徑之外，還有一部分Notch 信號是通過非經典Notch 信號通路實現的。非經典Notch信號通路在果蠅中被廣泛研究，目前在哺乳動物中的研究較少，其具體的調控機制尚不明確。非經典Notch 信號通路主要包括DSL 配體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1 和 Jagged2）非依賴性Notch信號、蛋白酶非依賴性Notch信號、CSL非依賴性Notch 信號、Notch 靶基因的非經典活化等［12］。在哺乳動物中，Delta樣非經典Notch配體1（Dlk1）具有生長調節作用，其通過Notch依賴和非依賴機制參與調節組織器官（如肝臟）的發育和再生過程［13］。

1.3 Notch 信號通路的調控 在Notch 信號傳遞過程中，有多種機制參與調控Notch 信號通路。DNA甲基化是研究最廣泛的表觀遺傳調控機制，其改變不僅參與調節HSCs活化和肝纖維化發生，而且可直接影響Notch 受體的表達［14］。在新鮮分離的HSCs中，Notch1 受體表達明顯高于Notch3 受體，而Notch3 DNA 甲基化水平明顯高于Notch1；在原代HSCs培養活化過程中，Notch3位點DNA逐漸去甲基化，Notch3受體表達顯著上調，而Notch1則呈現相反的趨勢，這表明DNA甲基化調節Notch受體表達［15］。Deltex4 是Notch 信號通路的重要調節因子，其對Notch 信號通路的調控效應取決于細胞類型和相互作用的分子，在HSCs 活化過程中，Deltex4 啟動子DNA 甲基化降低，Deltex4 基因表達增加，伴隨HSCs Notch3 受體表達上調，Notch1 和 Notch4 受體表達減少［16］。泛素化是蛋白質翻譯后修飾的重要方式，蛋白質泛素化通常使蛋白質更易于降解。在肝纖維化過程中，E3 泛素連接酶WW 結構域包含蛋白2（WWP2）促進NICD3 單泛素化，增加NICD3 溶酶體途徑降解，蛋白磷酸酶1G通過與WWP2相互作用負向調控WWP2 活性，而中藥單體木香烴內酯能夠阻斷蛋白磷酸酶1G與WWP2復合體形成，促進NICD3降解，進而抑制Notch3/Hes1 通路和肝纖維化發生［17］。非編碼RNAs 是一類從基因組轉錄產生的但不編碼蛋白質的RNA，其作為調節因子廣泛參與各種生物學功能。microRNA 是非編碼RNA 的重要組成部分，在轉錄后水平參與調節基因表達。在HSCs中，miRNA-25-3p 靶向抑制Notch 信號（共）激活因子ADAM-17 和 FK506 結合蛋白14（FKBP14），減少Notch1 受體裂解和NICD1 核移位，進而抑制Notch1信號和肝纖維化［18］。在 TGF-β1 刺激活化的 HSCT6細胞中，miR-200a通過靶向負性調控Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶SIRT1 而上調Notch1 表達，進而抑制HSC-T6 活化和纖維化形成［19］。除 miRNA 外，長鏈非編碼RNA（lncRNAs）也參與調控Notch信號通路。肝纖維化相關lncRNA1（lnc-LFAR1）可直接與Smad2/3結合，促進TGF-β、Smad2、Smad3、Notch2和Notch3 轉 錄 ，沉 默 lnc-LFAR1 可 抑 制 Notch2、Notch3、Hes1 和 Hey2 表達，這表明 lnc-LFAR1 通過活化 TGF-β 和 Notch 信號通路促進 HSCs 活化和肝纖維化發生［20］。lncRNA Meg8 在活化的HSCs、受損的肝細胞和纖維化肝臟中表達上調，而沉默lncRNA Meg8 可促進原代 HSCs 和肝細胞 Notch2、Notch3 和Hes1 表達，提示 lncRNA Meg8 通過抑制 Notch 信號通路抑制HSCs活化和肝細胞上皮間充質轉化［21］。

2 Notch信號通路與肝纖維化

2.1 Notch信號通路與HSCs HSCs是位于Disse 間隙內的肝臟間質細胞，正常情況下，HSCs 處于靜止狀態，胞質內有多個富含維生素A的脂滴，是機體儲存維生素A的主要細胞［1］。在各種肝損傷因素刺激作用下，靜止型HSCs 發生活化。大量研究表明HSCs 活化、增殖是肝纖維化發生的中心事件，活化的HSCs形態和功能發生一系列改變，轉變為肌成纖維細胞，分泌大量的細胞外基質，導致肝纖維化。眾多信號通路參與HSCs 活化，其中Notch 信號通路具有重要作用。在原代HSCs 體外培養活化過程中，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原、N-鈣黏蛋白、Notch 2、Notch 3及Notch靶基因Hey2、HeyL表達上調，E-鈣黏蛋白和上皮細胞標志細胞角蛋白（CK）-19、CK-7表達下調，提示原代HSCs體外培養時Notch信號通路活化和存在自發上皮間充質轉化，而使用Notch受體阻斷劑DAPT可顯著抑制α-SMA、Ⅰ型膠原和N-鈣黏蛋白表達，增加E-鈣黏蛋白和上皮細胞標志CK-19、CK-7表達，表明Notch信號通路參與HSCs 活化和上皮間充質轉化［22］。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）上調肝星狀細胞LX2 Notch1 和Notch信號通路下游Hes1 和Sox2 蛋白表達，促進HSCs 增殖，沉默Notch1抑制Sox2蛋白表達和HSCs 增殖，提示AngⅡ通過激活Notch1/Sox2通路促進肝星狀細胞LX2 增殖［23］。在肝纖維化大鼠和 TGF-β1 活化的HSCs 中，Notch3、jagged 經典 Notch 配體 1（JAG1）和Hes1 表達上調，基因沉默JAG1 抑制HSCsⅠ型膠原和α-SMA表達，表明激活Notch信號通路促進HSCs活化和肝纖維化發生，進一步研究發現miR-489-3p通過與JAG1 mRNA 3'非編碼區相互作用靶向下調JAG1表達、負向調節JAG1/Notch3信號通路，進而抑制HSCs 活化［24］。在活化HSCs 中，Hes1 和晝夜節律分子神經元PAS結構域蛋白2（NPAS2）表達增加，過表達Hes1 或NPAS2 促進HSCs 活化和膠原沉積，敲低Hes1 或NPAS2 則產生相反的效應，同時，過表達或敲低NPAS2，HSCs中Notch受體無明顯改變，進一步熒光素酶報告基因檢測提示NPAS2 直接轉錄激活HSCs 中的 Hes1，進而促進 HSCs 活化［25］。這提示NPAS2 是通過非經典Notch 信號通路活化Notch 信號，促進HSCs活化和肝纖維化發生的。

2.2 Notch 信號通路與巨噬細胞 巨噬細胞是機體非特異性免疫系統的重要組成部分，肝臟巨噬細胞包括肝內定居的枯否細胞和來源于骨髓的單核細胞源性巨噬細胞。巨噬細胞在肝纖維化的發病機制中具有雙重調控作用，在肝纖維化形成期，巨噬細胞釋放多種促炎細胞因子或趨化因子活化HSCs，促進細胞外基質沉積和纖維化發生。在肝纖維化逆轉期，巨噬細胞分泌抗炎細胞因子抑制炎癥，促進細胞外基質降解，減輕肝纖維化［26］。在肝纖維化發生過程中，Notch信號通路通過參與巨噬細胞活化促進肝纖維化發生發展。感染血吸蟲小鼠的肝臟巨噬細胞表現為M2型極化，Notch1/Jagged1信號在M2型巨噬細胞中表達顯著上調，應用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch 信號通路可逆轉巨噬細胞M2 型極化，減輕血吸蟲病小鼠肝臟肉芽腫和纖維化，這表明依賴Notch1/Jagged1信號的巨噬細胞M2型極化在血吸蟲病肝肉芽腫和纖維化中具有重要作用［27］。在脂肪肝的發病機制中，DLL4-Notch軸促進促炎巨噬細胞活化，增加胰島素抵抗，加重脂肪肝［28］。在四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化小鼠模型中，辣椒素通過抑制Notch 信號減少M1 型巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α），進而抑制肌成纖維細胞再生和肝纖維化形成，這表明Notch信號通路通過調節肝臟巨噬細胞功能參與肝纖維化形成［29］。在細胞共培養體系中，Notch 信號在HSCs 和巨噬細胞中的相互作用決定了肝纖維化形成的轉歸，活化的HSCs促進促炎巨噬細胞極化，應用γ-分泌酶抑制劑預處理HSCs 后則可抑制促炎巨噬細胞極化，促炎巨噬細胞也可促進HSCs 活化，而應用γ-分泌酶抑制劑預處理促炎巨噬細胞后也可抑制HSCs 活化［30］。這表明不同類型細胞間Notch 信號相互作用也參與肝纖維化的發生。

2.3 Notch 信號通路與肝細胞 肝細胞是肝臟中數量最多的細胞，各種損傷因素刺激肝臟后，肝細胞通過旁分泌、凋亡等機制活化HSCs，促進肝纖維化形成。肝細胞Notch 信號通路通過改變肝細胞功能影響HSCs 活化和肝纖維化發生。雷公藤內酯通過抑制肝細胞中Notch1介導的PTEN/Akt/Txnip信號傳導而損害硫氧還蛋白系統，啟動肝細胞氧化應激，進而導致肝細胞凋亡和肝損傷，而過表達NICD1 則抑制雷公藤內酯誘導的肝細胞凋亡和肝損傷，表明Notch1對雷公藤內酯誘導的肝細胞毒性具有保護作用［31］。在肝纖維化過程中，特異性表達于肝細胞的lnc-Hser 表達顯著減少，沉默lnc-Hser 上調肝細胞Notch2、Jagged1 和 Hes1 表達，增加間充質標志基因N-鈣黏蛋白、波形蛋白和蝸牛家族轉錄抑制因子1表達，促進肝細胞上皮間充質轉化，而應用Notch 受體阻斷劑則能夠抑制lnc-Hser沉默所誘導的肝細胞上皮間充質轉化，表明Notch信號通路促進肝細胞上皮間充質轉化［32］。正常肝臟中肝細胞Notch 信號幾乎完全被抑制，而在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者中，肝細胞Notch 活性與病情的嚴重程度呈正相關，特異性活化肝細胞Notch信號加重飲食誘導的小鼠NASH和肝纖維化，特異性失活肝細胞Notch信號則能夠阻斷NASH 相關肝纖維化，表明NASH 飲食誘導的肝纖維化的發展依賴肝細胞Notch信號活化，進一步研究發現，Notch活化介導肝細胞骨橋蛋白分泌，進而促進HSCs活化和肝纖維化，藥物抑制Notch信號通路則減輕NASH相關肝纖維化［33-34］。

2.4 Notch 信號通路與肝竇內皮細胞 肝竇內皮細胞（LSECs）是肝臟中最豐富的非實質細胞群。在正常情況下，LSECs具有獨特的窗孔結構，并缺乏基底膜，這些結構特點讓LSECs具有高通透性，有利于肝細胞和肝血竇之間進行物質交換。LSECs在維持肝內穩態中具有重要作用，其通過阻止枯否細胞與HSCs 活化，調節肝內血管阻力和門脈壓力，具有抗炎、抗纖維化特性［35］。在病理狀態下，LSECs窗孔消失，并伴隨基底膜形成，此即肝竇毛細血管化，肝竇毛細血管化與肝纖維化的發生密切相關。在纖維化肝臟和體外培養的原代LSECs中，CD31和血管性血友病因子（vWF）表達增加，LSECs 窗孔數量明顯減少，提示肝竇毛細血管化，同時伴隨Notch配體DLL4表達上調，過表達DLL4 促進LSECs 基底膜形成和HSCs 對肝竇的覆蓋，而應用Notch 信號通路阻斷劑DAPT或沉默DLL4則抑制LSECs窗孔缺失和基底膜形成，減輕CCl4誘導的肝纖維化。這表明DLL4通過調節肝竇毛細血管化促進肝纖維化形成［36］。生理狀態的LSECs 通過產生一氧化氮維持HSCs 處于靜止狀態，并促進活化的HSCs 逆轉為靜止狀態，毛細血管化的LSECs一氧化氮產生減少，這有利于HSCs活化［37］。內皮特異性Notch 活化抑制內皮型一氧化氮合酶/可溶性鳥苷酸環化酶信號，導致LSECs毛細血管化，進而促進HSCs活化和肝纖維化［38］。

3 總結與展望

綜上所述，Notch信號通路在肝纖維化的發病機制中具有重要作用，其通過介導細胞間相互作用與組織器官發育和穩態維持密切相關，非特異性抑制Notch信號通路將產生一系列不良反應。因此，靶向阻斷Notch 信號通路或傳遞Notch 抑制劑為更佳的治療策略。最近有研究表明靶向傳遞Notch 抑制劑能夠改善飲食誘導的小鼠糖耐量異常和NASH相關肝纖維化，避免胃腸道不良反應［39］。目前對于非經典Notch 信號通路在肝纖維化中的作用了解尚少。由于其與多條信號通路密切相關，故研究非經典Notch 信號通路在肝纖維化中的作用有利于進一步認識肝纖維化的發病機制和開發新的抗纖維化方案。