食品中志賀菌檢測方法的研究進展

韋麗琴

（天峨縣疾病預防控制中心，廣西 河池，547300）

志賀菌病（Shigellosis），也稱桿菌性痢疾，是一種主要由志賀菌（Shigella spp.）引起的急性直腸-結腸炎，臨床癥狀表現為水樣泄，粘液膿血便，里急后重，部分患者有劇烈頭痛、嗜睡、意識模糊、驚厥等神經癥狀。近年來，隨著生活方式與飲食結構的不斷改變，我國感染志賀菌幾率逐漸增加，據調查，全世界每年有1.6 億左右人感染志賀菌，有110 萬人左右因志賀菌死亡，其中以兒童最為常見[1]。在我國，志賀菌感染患病率為百萬分之六十五[2-3]。食品中志賀菌主要是經過食用被志賀菌污染的食物而感染疾病，以全身中毒癥狀、大腸化膿性炎癥以及潰瘍等為主要臨床特征，其主要經過消化道途徑傳播，侵襲腸上皮細胞，進而引起發熱、腹瀉、腹脹等癥狀，對患者身體健康與生命安全造成嚴重影響。目前最常用的志賀菌增菌液培養志賀菌標準菌株研究中，發現部分志賀菌生長量顯著低于大腸桿菌等，且延遲期也較為落后。同時在普通校驗培養基中部分痢疾志賀菌與鮑氏志賀菌生長不良，造成雜菌較多，因此極易引發誤檢與漏檢[4]。故針對食品中志賀菌采取高效、準確性高的檢測方法，對疾病的防控具有重要意義。現將食品中志賀菌檢測方法的研究進展做一綜述。

1.食品中志賀菌檢測方法

近年來，隨著生物實驗技術不斷發展，食品中志賀菌檢測與鑒定技術也在逐漸完善，其中包括常規生化檢測、快速生物檢測儀器法、免疫學檢測以及分子生物學檢測。

1.1 常規檢測技術

食物中志賀菌檢測方式以國標法（GB 4789.5-2014）為主要檢測方式，檢驗程序：增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離培養，革蘭氏染色、鏡檢，生化試驗與血清學分離鑒定。此種檢測方式主要為微生物培養法，操作方式較為繁瑣，檢測周期較長，且靈敏度、特異度較低[5]；同時一次檢測完成樣品項數較少，無法應對市場迅速、準確檢驗方式的需求，但這種檢測方式具有直觀、穩定性佳、假陽性率低等優點。國標法實施常規生化鑒定方式對食物中志賀菌進行檢測，整個檢測過程需4～5d。相關報道顯示，經過對SS、Mac、HE 以及MT 培養基進行對比，結果得出，SS 培養基對食物中志賀菌檢出率比較高，為降低漏檢、誤診等發生率，可同時使用Mac 培養基進行檢測，以提升檢測準確性與檢出率。

1.2 快速生物檢測儀器法

微生物自動化檢測具有操作簡便、便捷、準確性高等優點，是微生物檢測發展方向之一。國內外已有多種全自動微生物分析系統問世[6]。例如Autoseptor 系統、Sensititre 系統、vitek一Ams 系統、Vitek 系統以及Midd 系統。其中法國生物梅里埃公司的Vitek-Ams 系統是眾多全自動微生物分析系統里唯一被美國分析化學家協會（AOAC）定為的標準方式，此系統是以每種細菌的微量生化反應為基礎，儀器定時自動檢測微量培養基的發酵情況，計算機依據接收的發酵資料實施換算，并與數據庫所得檢驗結果實施對比[7]。

1.3 免疫學檢測技術

隨著免疫學逐漸完善，以最初凝聚試驗、沉淀試驗以及補體結合試驗等免疫學檢驗方式，到先進酶聯免疫吸附法、免疫印跡等方式，為迅速檢驗志賀菌提供了新的檢測技術。

1.3.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法（ELISA）主要是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應以及酶對底物的高效催化作用相結合的一種的敏感性較高試驗技術。相關研究顯示，ELISA 具有較高的敏感性以及特異性，所有可溶性的抗體抗原反應系統均可檢測，最小檢測值可達至微克水平[8]。該檢測方式與放射免疫方式對比，ELISA 的標記試劑較為穩定，同時無放射性損傷[9]。

1.3.2 免疫印跡

免疫印跡又可稱之為蛋白質印跡，其是一種利用特異性抗體鑒定抗原方式，使用免疫印跡方式檢測無需采取特殊設備，且操作簡便、檢測準確性較高。相關研究顯示，使用IPaC 蛋白單克隆抗體免疫印跡方法檢測大便樣品中的大腸埃希菌與志賀菌，結果顯示，其與PCR 方式檢測IPaC 蛋白基因結果相一致[10]。

1.4 分子生物學檢測技術

以分子生物學為基礎建立的眾多檢驗技術，以其迅速、準確以及高特異性等優點成為生物技術革命的新產物，已廣泛應用于食源性致病菌的檢測中。隨著微生物學、分子生物學以及生物化學等迅猛發展，對病原微生物鑒定已不再局限于對其形態結構與生理特性等實施檢驗，以此從分子生物學水平上對生物大分子進行研究，尤其是在核酸結構與其組成部分。在此基礎上建立多種檢驗技術。其中包括聚合酶鏈反應（PCR）技術、基因芯片等，逐漸應用于食源性病原菌的迅速檢驗中。

1.4.1 常規聚合酶鏈式反應（PCR）

常規PCR 主要采取瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢查結果，其結果主要經過目測有無擴增條帶實施判斷，因此存在一定的主觀性。常規PCR 需明確待擴增目的片段的序列，依據此序列設計一對應引物。相關報道顯示，將志賀菌ipaH 基因序列作為靶目標，設計一對引物（5’GTTCCTTGACCGC-CTTTCCGATAC-3’與5’GCCGGTCAGCCACCCTA-3’），擴增產物為700bp，其對臨床上疑似菌痢的糞便標本實施檢測，并以PCR 為金標準，培養法敏感性、特異性分別為72%與100%[11]。

1.4.2 RT-PCR

RT-PCR 技術主要是在PCR 反應體系中加入熒光基團，選用熒光信號對PCR 整個進程實時檢測，隨后經過標準曲線定量分析未知模板[12]。熊輝[13]研究顯示，對2700 份肛拭子樣本使用雙色RT-PCR 法檢測志賀菌，結果顯示，雙色RT-PCR 檢出率0.11%高于培養法0.00%。盡管RT-PCR 檢測成本較高于熒光探針保持時間較短，但在線式采取檢測熒光信號強弱改變，可有效避免常規PCR 受多因素干擾影響。

1.4.3 質粒圖譜分析

質粒圖譜主要是經過分析細菌中所攜帶的質粒分子量，以及其在電泳道上形成圖譜特點鑒定細菌的技術。因同源性菌株所攜帶的質粒相似，故常采取檢測質粒圖譜的方式分析細菌來源及其某些遺傳性狀。質粒圖譜分析方式是一種簡便、迅速以及可靠的檢測方式，故使用此種方式對志賀菌實施分子流行病學研究，有利于追蹤傳染源與掌握流行株的耐藥情況，以此為臨床治療、菌痢的檢測提供有效的理論依據[14]。

1.4.4 核糖體分型

核糖體16S rRNA 分型也是制定志賀菌亞型的分子生物學方式，其主要是借助限制性內切酶將核糖體16S rRNA 核酸序列裂解為若干片段，使用電泳方式對片段進行分離，同時將不同來源菌株進行結果對比，對不同菌株間變異特點進行分析，以此為流行病學提供有效的理論依據。但核糖體分型在檢測志賀菌中效果并不佳，此種方式分型效力與質粒圖譜不同，多種不同來源的志賀菌使用質粒圖譜可分為若干型別，但使用核糖分型卻無法顯示出[15]。

1.4.5 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

PFGE 是目前實施志賀菌流行病學分析最常用方式之一，其主要是借助限制性內切酶識別核酸序列上的特異位點，其將整個細菌染色體組裂解分為若干片段，經過脈沖場電泳分離成像，通過不同圖型間對比，以此對同一菌種亞型的不同菌株來源及其特點進行分析。雷高鵬[16]研究顯示，對30 株宋內志賀菌實施PFGE 分型分析，結果顯示，2007-2017 年四川省腹瀉病例宋內志賀菌分離株PFGE 優勢帶型明顯，且部分帶型存在聚集。病原菌基因片段位置與大小表現存在多態性，對志賀菌分離株之間的同源性、傳染源追溯、疫情預測、防治措施提供有效的理論依據。

1.4.6 基因探針雜交與基因蕊片

基因探針是使用人工合成的方式從微生物中制備相應的DNA 片段，進行純化后標記上同位素、熒光物質以及生物等，進而制成特異性DNA 探針，經過對待測樣本、標志性DNA 探針之間能否形成雜交分子進行檢測，以此對樣品中是否存在目標微生物進行評估。但極易引起假陽性，不利于應急處理的迅速檢測。而基因芯片主要是使用原位合成或顯微打印方式，將數以萬計的DNA 探針固化在支持物表面，以此產生二維DNA 探針陣列，與標志的物品實施雜交，經過檢測雜交信號來實現對生物樣品迅速、并行以及高效檢測或醫學診斷。基因芯片技術具有一定的敏感性高、特異性強以及操作簡便等優點，其在腸道致病菌檢測中具有較大的應用價值。

2.小結

目前針對食品中志賀菌的檢測方式，主要包括常規生化檢測、快速生物檢測儀器法、免疫檢測法、分子生物學方式等，上述的檢測方式均有其各自優缺點，其中ELISA 在檢測食品中志賀菌中具有操作簡便、迅速以及準確性高等優點，并已在臨床中廣泛應用。因此在檢驗食品中志賀菌中，應充分掌握各種檢測技術的應用范圍、局限性等，同時結合實際情況，不斷完善、改進食品中志賀菌檢測方式。同時還需建立、健全食品法律法規，以增強食品安全監控，以提升檢測技術，促使食品快速檢測技術達到國際先進水平。