基于HPLC指紋圖譜建立醫(yī)院紫草藥材驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)*

于 典，黃 磊△，華國棟，何 婷，鞏 穎，楊 維

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100078； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100700）

對(duì)中藥功效的深入研究發(fā)現(xiàn)，單一的活性成分或指標(biāo)性成分均難以反映中藥的真?zhèn)魏唾|(zhì)量［1］。通用現(xiàn)代的分析技術(shù)分析中藥和中藥復(fù)方，能為鑒別中藥材的真?zhèn)魏唾|(zhì)量提供有效參考［2］，其中建立指紋圖譜是評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和基礎(chǔ)［3］。指紋圖譜的參照物質(zhì)多選擇藥材中易獲取的主要活性成分或指標(biāo)性成分，以考察藥材圖譜穩(wěn)定性及輔助辨別圖譜重復(fù)性。若臨床藥效未能取得確切關(guān)聯(lián)，則指紋圖譜的參照物將起到辨別和評(píng)價(jià)藥材圖譜特征的引導(dǎo)作用［4］。萘醌類、苯醌類、黃酮類、生物堿類及多糖類物質(zhì)是藥用紫草的主要活性成分，其中萘醌類化合物的抗癌作用和較強(qiáng)的脂溶性特征是當(dāng)前紫草研究的熱點(diǎn)，左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β－β′二甲基丙烯酰紫草素、β－羥基異戊酰紫草素、去氫阿卡寧和β－羥基異戊酰阿卡寧等物質(zhì)也均是紫草的主要物質(zhì)成分［5］。本研究中選取左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β－β′－二甲基丙烯酰紫草素為參照物，建立了紫草藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BSA124S型分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為0.0001 g）。

1.2 試藥

左旋紫草素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110769－200506，含量≥95%）；乙酰紫草素對(duì)照品（上海士鋒生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為15062715，含量≥98%）；去氧紫草素對(duì)照品（北京邁瑞達(dá)科技有限公司，批號(hào)為19072541，含量≥98%）；β－β′－二甲基丙烯酰紫草素對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為Y02A9H67135，含量≥98%）；紫草（批號(hào)分別為ZC－2020001和ZC2020002的來自新疆哈密，批號(hào)分別為ZC－2020003和ZC－2020004的來自新疆阿勒泰，批號(hào)分別為ZC－2020005和ZC－2020006的來自新疆喀什，批號(hào)分別為ZC－2020007和ZC－2020008的來自新疆烏魯木齊，批號(hào)分別為ZC－2020009和ZC－2020010的來自尼泊爾）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP－ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.3%磷酸水溶液（梯度洗脫，洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長：274 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液制備

稱取左旋紫草素對(duì)照品、乙酰紫草素對(duì)照品、去氧紫草素對(duì)照品、β－β′－二甲基丙烯酰紫草素對(duì)照品各10.00 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，分別以流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為0.7，1.0，1.5，1.0 mg／mL的對(duì)照品溶液；各精密量取1 mL，置同一100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。取紫草樣品粉末（過60目篩）0.5 g，精密稱定，加入6倍量的乙醇溶液于具塞錐形瓶中，室溫下密封、遮光。冷浸提取后，過濾，并收集濾液，制成濃縮、干燥的浸膏，加10 mL甲醇使溶解，冷卻至室溫，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，理論板數(shù)按左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫素、β－β′－二甲基丙烯酰紫草素峰計(jì)均大于3000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.L－shikonin 2.acetylshikonin 3.deoxyshikonin 4.β－β′－dimethylacryl shikonin A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗(yàn)：取紫草藥材樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄相對(duì)保留時(shí)間及色譜峰面積。結(jié)果的RSD均小于1.1%（n＝6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：2.2項(xiàng)供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，12，18，24，32，40，48 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄相對(duì)保留時(shí)間及色譜峰面積。結(jié)果的RSD均小于2.1%（n＝10），表明供試品溶液室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次紫草藥材樣品6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄相對(duì)保留時(shí)間及色譜峰面積。結(jié)果的RSD均小于1.4%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

耐用性試驗(yàn)：使用不同型號(hào)的儀器、不同批次、不同柱溫（28，30，32℃）的色譜柱對(duì)同一批次紫草藥材樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其相似度。結(jié)果表明，在一定波動(dòng)范圍內(nèi)，各共有峰的分離度無明顯差異，說明指紋圖譜測(cè)定方法的耐用性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與評(píng)價(jià)

2.4.1 紫草指紋圖譜的建立

選擇10批次紫草藥材，分別按上述建立的指紋圖譜測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.0版）擬合生成對(duì)照指紋圖譜，以峰面積＞12.5%的10號(hào)峰（去氧紫草素）為對(duì)照峰，0.5%＜峰面積＜12.5%的分別為第1～9號(hào)和第11～14號(hào)峰，這14個(gè)峰的面積之和占共有峰總面積的90%，詳見圖2。10批藥材對(duì)照指紋圖譜見圖3。

圖2 10批藥材疊加指紋圖譜Fig.2 Superimposed HPLC fingerprints of 10 batches of Arenbiae Radix

圖3 10批藥材對(duì)照指紋圖譜Fig.3 Reference fingerprint of 10 batches of Arenbiae Radix

2.4.2 相似度評(píng)價(jià)

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.0版）建立共有模式，對(duì)圖譜數(shù)據(jù)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜S，計(jì)算10批紫草藥材提取物圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜間的相似度。結(jié)果多超過0.7，見表2。

表2 10批不同產(chǎn)地紫草的HPLC指紋圖譜相似度Tab.2 Similarity of HPLC fingerprints of 10 batches of Arnebiae Radix from different producing areas

3 討論

當(dāng)前市場(chǎng)紫草品種良莠不齊，2020年版《中國藥典（一部）》對(duì)藥用紫草的描述特征不鮮明，且在紫草指紋圖譜方面尚未建立對(duì)應(yīng)的質(zhì)量規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。紫草的市場(chǎng)來源較復(fù)雜，實(shí)際流通的并非僅藥典規(guī)定的新疆紫草和內(nèi)蒙古紫草，還有更多不同的紫草品種無法通過《中國藥典》的性狀描述準(zhǔn)確鑒別［6］。不同的種植地點(diǎn)、采收期、貯藏條件、運(yùn)輸條件等均會(huì)對(duì)藥材產(chǎn)生較大影響，導(dǎo)致現(xiàn)在市場(chǎng)紫草藥材的質(zhì)量難以控制［7］。

為了規(guī)范新疆紫草市場(chǎng)，應(yīng)建立有效的含量測(cè)定方法，保證紫草藥材質(zhì)量的有效性和安全性［8］。指紋圖譜為全面說明中藥化學(xué)成分特點(diǎn)的一種新技術(shù)，可表征中藥樣本的特征成分［9］。中藥指紋圖譜為綜合性鑒別方法，其應(yīng)用范圍是鑒別真?zhèn)危u(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量均勻性和穩(wěn)定性［10－11］。采集藥材組的指紋圖譜，弄清中藥材化學(xué)成分的多樣性和復(fù)雜性，是科學(xué)合理地控制中藥材質(zhì)量的有效途徑［12－13］。本研究結(jié)果顯示，樣品指紋圖譜和對(duì)照藥材指紋圖譜中所含化學(xué)成分基本相同，但不同市場(chǎng)圖譜中特征峰數(shù)量和各特征峰面積均存在較大差異，表明新疆紫草萘醌提取物在不同來源的組成相似，但含量差異大。

本研究中建立的紫草指紋圖譜用于紫草藥材的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，即已明確該藥材為紫草的前提下，用指紋圖譜控制紫草的入院質(zhì)量，目的是用于控制入院紫草藥材的質(zhì)量均一性及保證臨床療效的均一性。且本研究建立的指紋圖譜雖僅選擇了2個(gè)大類產(chǎn)區(qū)、5個(gè)小類產(chǎn)區(qū)，指紋圖譜的色譜峰選擇受到一定限制，但更細(xì)化的區(qū)分則有利于研究的深入開展。