正交試驗優選當歸藥材中阿魏酸提取工藝

陳良勝

（河南省信陽市新縣人民醫院，河南 信陽 465550）

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，臨床常與川芎、白芍、地黃等配伍，常用于活血化瘀。藥理學研究表明，當歸能模擬小劑量阿司匹林的作用，調節血脂［1］。其有效成分主要為阿魏酸，屬酚酸，為桂皮酸的衍生物，一般用其反式體。阿魏酸見光易分解，其水溶液穩定性較差，形成鈉鹽后穩定性較好，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，難溶于石油醚［2］。阿魏酸的抗氧化性很強，具有抗菌消炎、抑制肝功能損傷等作用。從植物中提取分離天然阿魏酸的方法有堿水解法、酶解法、組織培養法等。目前仍以堿水解法為主，雖有成本低、產量高等優點，但其產生的廢渣、廢液所帶來的環境問題不容忽視［3］。近年來，超臨界CO2萃取法、連續回流提取法、高壓法、超聲波等方法多有應用，但操作煩瑣，價格昂貴。閃式提取法在操作方法、能耗、時程、提取效率及應用范圍方面均優于傳統方法［4－5］。本研究中基于正交試驗對當歸藥材中阿魏酸的閃式提取法進行了優化。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JHBE－50T型閃式提取器（上海釩幟精密設備有限公司）；LG16－W型離心機（北京離心機有限公司）；755B型紫外－可見分光光度計（四川中浪科技有限公司）；QKCF型超純水器（南京權坤生物科技有限公司）；Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BT 124 S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；FS－750T型超聲儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

當歸飲片，我院中藥房用當歸藥材（采自海拔超過1000 m的山上，經新縣人民醫院執業藥師殷雙興鑒定為正品）自制；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為20180423，含量為99%）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 阿魏酸含量測定

2.1.1 色譜條件［6］

色譜柱：TSK－GEL DDS－C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇－水－磷酸（30∶70∶0.3，V／V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：315 nm；柱溫：40℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取阿魏酸對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成質量濃度為10μg／mL的對照品溶液。取藥材樣品適量，研磨成細粉，取約0.5 g，精密稱定，置有塞250 mL磨口錐形瓶內，加入90%甲醇和鹽酸（100∶1，V／V）混合溶液10 mL，稱定質量，超聲（功率750 W，頻率20 kHz）處理0.5 h，再次稱定質量，用上述混合溶液補足減失的質量，經0.2μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.1.2項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰。理論板數按阿魏酸峰計應不低于3000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.ferulic acid A.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取對照品溶液1，5，10，15，20，25μL，稀釋2倍，制成系列對照品溶液。按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝4573764 X－3878.590，r＝0.9999（n＝6）。結果表明，阿魏酸進樣量在0.0070～0.1500μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.1.2項下對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果的RSD為0.39%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.1.2項下供試品溶液適量，室溫下分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.20%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置3.0 h內穩定性良好。

重復性試驗：取藥材樣品粉末適量，精密稱定，共8份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果的RSD為1.10%（n＝8），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品，共6份，加入一定量的阿魏酸對照品溶液，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery tests（n＝6）

2.2 閃式提取法正交試驗［7］

以乙醇體積分數（因素A）、料液比（因素B）和提取時間（因素C）為三因素，以阿魏酸含量為評價指標進行L9（34）正交試驗。詳見表2至表4。由表3和表4可見，因素A、因素C對提取結果有顯著影響，影響強度為A＞C＞B，最佳工藝為A2B2C2，即以12倍量70%乙醇，閃式提取1.5 min。

表2 因素水平表Tab.2 The factor levels

表3 正交試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of ANOVA

2.3 驗證試驗

取當歸藥材粉末100 g，按最優工藝進行閃式提取，平行操作3次。結果阿魏酸含量分別為0.2927，0.2930，0.2918 mg／g，平均0.2925 mg／g，與正交設計中的方案6的提取得率接近，RSD為0.21%，表明該工藝穩定可行，具有可操作性和重復性。

2.4 乙醇回流提取法［8］

我國藥廠多采用乙醇加熱回流提取法提取當歸藥材中的阿魏酸，現將該法與本研究中優選出的閃式提取法的提取效果進行比較。乙醇加熱回流提取工藝中乙醇體積分數及料液比不變，提取次數為3次，提取時間為2.5 h。取3批當歸藥材樣品進行試驗，結果閃式提取法和加熱回流提取法所得阿魏酸含量分別為0.3324 mg／g和0.2773 mg／g。可見，在各種因素相同的情況下，閃式法提取時間是傳統乙醇回流提取法的1／100，且前法所得阿魏酸含量較高。既節省了時間，又降低了能耗。

3 討論

國內對阿魏酸的提取現多采用傳統工藝，具有操作不易、能耗大、費時長、有效成分破壞較多等缺點，導致提取效率低下［9］。本研究中優選閃式提取法的最優提取參數，通過查閱資料及前期的預試驗，選用乙醇體積分數、料液比和提取時間為三因素，結合L9（34）正交試驗設計對阿魏酸的提取方案進行優化，得最優工藝為乙醇體積分數為70%，料液比為1∶12，閃式提取1.5 min。與傳統提取方法相比，閃式提取法所需乙醇體積分數較低，操作簡便，提取時間短，提取率高。且該型號電機功率為1800 W，完成1次提取只需1.5 min，與回流提取方法相比，單位能耗明顯降低［10］。可見，閃式提取法簡單易操作，可為阿魏酸的開發及研究提供參考［11－15］。