云芝糖肽化學成分的研究進展*

張 圓，孫玉娣，劉 璇，石蓓佳，陸益紅**

（1.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院生物技術藥品檢驗一室，江蘇 南京 210019；2.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 210000）

云芝（Trametes versicolor） 又名彩絨革蓋菌、雜色云芝、彩紋云芝、黃云芝、灰芝、瓦菌、千層蘑、云蘑等，隸屬真菌門（Eumycota） 擔子菌亞門（Basidiomycotina） 多孔菌科（Polyporaceae） 栓菌屬（Trametes）[1]。具有增強免疫、抑制腫瘤等功效[2]。對云芝化學成分的研究主要集中在云芝子實體中提取的子實體多糖（糖肽）、從液態發酵培養的菌絲體中提取的胞內糖肽和從液態發酵培養的發酵液中提取的胞外糖肽[3]。通過分析云芝糖肽的理化性質、一級結構的化學成分（單糖組成、多糖含量、氨基酸含量、肽含量、核苷和核堿組成、指紋圖譜）、二級結構（糖苷鍵分析、糖肽鍵的研究）、立體結構（分子量、糖肽蛋白結合態）的研究以及相關化學計量學等方面近年的相關文獻，對云芝糖肽的化學成分和研究方法進行綜述，為其更廣泛的應用提供參考和依據。

1 理化性質

PSP（polysaccharopeptide） 和 PSK（polysaccharide-krestin）是由云芝的液態發酵培養的菌絲體中提取的2種商品化糖肽類物質[2]。PSP是上海師范大學楊慶堯教授于1983年，由菌株Cov-1發酵64 h的菌絲體中通過水提醇沉的方式提取出來[4]；PSK是日本吳羽化學工業公司于1966年，由菌株CM-101發酵10 d的菌絲體中通過水提鹽（硫酸銨）析的方式提取出來[4]，二者均具有提高機體免疫功能和抑制腫瘤的活性。

PSK含有氧47.5%、碳40.5%、氫6.2%、氮5.2%[2]，含碳水化合物34%～35%、蛋白質28%～35%、灰分6%～7%和水分7%，其余是還原糖和氨基酸[2]。PSP含有可溶性碳水化合物46%、蛋白質31%、不可燃物質15%[4]。PSP和PSK易溶于水，不溶于甲醇、吡啶、氯仿、苯和正己烷[2]，二者無固定的熔點，加熱至120℃以上后會焦化[4]。

2 一級結構化學成分研究

2.1 單糖組成

應用于云芝糖肽單糖組成的分析方法主要有衍生化氣相色譜法、柱前衍生化-高效液相色譜法/液質聯用法，高效液相色譜-蒸發光散射法（HPLCELSD）、高效液相色譜-示差折光法（HPLC-RI）、薄層色譜法（TLC） 等方法[5-8]。目前柱前衍生化-高效液相色譜法是在多糖分析中最常用的手段，反應操作簡便可控，無干擾峰，重現性好，利于定量分析，且衍生產物在質譜檢測器中響應較高且穩定，提高了檢測的靈敏度和專屬性[5]。

李娟等[5]將糖肽經三氟乙酸酸解后，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 柱前衍生，建立云芝糖肽單糖對照HPLC特征圖譜，測得含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖 （82.4∶6.3∶193.3∶100.0∶5.3∶4.0∶42.9） 7種單糖；并從單糖相似度、單糖組成摩爾比方面進行研究，結果表明，云芝糖肽與云芝胞內糖肽有明顯差異，云芝胞內糖肽的葡萄糖含量遠大于云芝糖肽。鄒巧根等[6]采用氫氧化鈉水解、硼氫化鈉還原、還原產物與吡啶-醋酐（1∶1） 發生衍生化反應，得到糖醇乙酰酯衍生物，并進行氣相色譜分析，檢測得到云芝糖肽（PSP） 中含有6種單糖：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖（0.544∶0.188 ∶0.180 ∶0.062 ∶0.018 ∶0.009）。張喆等[7]采用HPLC-ELSD和TLC法對云芝糖肽的單糖組成進行測定，結果表明云芝糖肽由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖 （1.000∶0.074∶0.067∶0.017 8） 組成，未檢出巖藻糖。Lin等[8]采用ddH2O為流動相，利用HPLC-RI法對云芝菌提取的糖肽粗品進行了單糖組成研究，葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的比例為 49.21∶17.06∶1.33∶32.40。

2.2 多糖含量測定

目前，云芝糖肽的國家標準采用無水葡萄糖為對照品，用硫酸-苯酚比色法測定總糖[9]。該方法專屬性不強，尤其樣品中單糖或小分子寡糖會影響多糖含量測定，使測定結果偏高[10]。

由于比色法測定多糖含量易造成結果偏差，李京等[10]采用高效陰離子交換-脈沖安培法測定云芝對照品胞內糖肽中的游離糖含量，從而排除比色法總糖測定中游離糖的干擾，結果未檢出游離糖。陳露等[11]采用DNS法，測得云芝胞內糖肽中還原糖的總量，結果高壓均質法提取得到的產物還原糖含量為0.4%，而熱水提取法未檢出。

2.3 氨基酸組成

PSP和PSK均含有18種氨基酸，目前一般采用水解后OPA/AQC衍生化-HPLC測定和氨基酸分析儀2種方法進行氨基酸組成分析[5，12]。

李娟等[5]將云芝糖肽經140℃，4 mol·L-1鹽酸溶液酸解2 h后，進行在線OPA衍生化，HPLCUV檢測后測得云芝胞內糖肽中含有16種氨基酸，天冬氨酸∶谷氨酸∶絲氨酸∶組氨酸∶甘氨酸∶蘇氨酸∶精氨酸∶丙氨酸∶酪氨酸∶胱氨酸∶纈氨酸∶甲硫氨酸∶苯丙氨酸∶異亮氨酸∶亮氨酸∶鹽酸賴氨酸（物質的量之比） 為 204.6∶145.6∶137.2∶28.6∶218.7∶63.8∶78.0∶100.0∶12.7∶5.3∶29.2∶5.7∶10.1∶15.0∶35.4∶116.2。Jeong等[12]采用氨基酸分析儀對云芝中的糖肽提取物CV-S2進行氨基酸分析，測得11種氨基酸，不同云芝糖肽柱層析分離產物的肽含量在4.1%～18.5%不等。

2.4 肽含量測定

目前，云芝糖肽的國家標準采用牛血清白蛋白為對照品，用福林酚法測定肽[9]，標準規定云芝糖肽蛋白質含量以牛血清白蛋白計，不得少于11.5%。但該方法的缺點是還原性物質（如葡萄糖、寡糖等）易干擾測定[13]。有文獻采用考馬斯亮藍法進行肽含量測定，測得云芝糖肽蛋白含量在約6%[6]。考馬斯亮藍試劑與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合，由于云芝糖肽主要含酸性和中性氨基酸（占比70%），可能造成蛋白含量偏低[13]。為更準確地反應糖肽中的肽含量，可考慮采用測定各氨基酸組成的方法，間接測定肽的含量。

2.5 核苷和核堿組成

云芝糖肽中含有多種核苷和核堿，尤以腺苷具有明顯的藥理作用，如改善心腦血液循環、防止心律失常、抑制神經遞質釋放和調節腺苷酸環化酶活性等[5]。

李娟等[5]采用超聲法提取云芝糖肽30 min，HPLC法測定出8種核苷的含量，胞嘧啶∶尿嘧啶∶胞苷∶次黃嘌呤∶尿苷∶腺嘌呤∶鳥苷∶腺苷（物質的量之比） 為 147.0∶73.1∶68.0∶100.0∶62.9∶135.4∶42.5∶60.5。楊豐慶等[14]利用毛細管電泳-質譜聯用技術測定靈芝藥材中8種核苷類成分，可為云芝糖肽的核苷成分測定提供技術參考。

2.6 指紋圖譜分析

由于云芝糖肽結構復雜，分子量較大，需要建立分離效率較高的指紋圖譜，區分力更強的化學計量學手段，識別共有峰和共有模式，以加強質控[15-20]。

袁萍等[15]建立了毛細管電泳分析云芝糖肽的方法，采用低波長和硼酸鹽緩沖液，檢測出15個指紋峰，將云芝糖肽與牛血清白蛋白分離。朱麗玢等[16]利用毛細管區帶電泳方法將云芝糖肽與市售糖肽類藥物進行區分。

目前用質譜法對云芝糖肽進行指紋圖譜的分析測定還未報道，相關多糖和糖肽的質譜研究報道可以為云芝糖肽的指紋圖譜研究提供有益的參考。

張洪濤等[17]采用快速蛋白液相色譜（fast protein liqiud chromatography，FPLC） 法分離香菇（Lentinus edodes）多糖，對于聚合度高于4的香菇多糖寡糖用電噴霧離子化-碰撞誘導解離質譜（electro-spray ionization-collision induced dissociation-mass spectrometer/mass spectrometer， ESI-CID-MS/MS） 法 測定其分子量，并對其多糖水解機制進行解析。王志軍等[18]利用TMS衍生化技術，建立了靈芝GC-MS指紋圖譜，檢出有機酸、多醇、氨基酸、腺苷、單糖、雙糖、糖醇、甾醇等多種物質。張順偉等[19]將此信息進行化學計量學分析，進行模式識別。楊秋霞等[20]運用傅立葉變換離子回旋共振質譜法（FTICR-MS）對赤靈芝的化學成分進行鑒定，采用ESI負離子模式，建立指紋圖譜分析方法，發現萜烯醛、糖、三萜醇、有機酸和三萜酸類成分。這些對于真菌類藥物化學成分的研究，可為云芝糖肽的化學組成的進一步探索提供技術支持。

3 二級結構研究

3.1 糖苷鍵分析

β-1,3/1,6-葡聚糖可通過與免疫系統信號蛋白進行識別進而激活免疫系統實現其生物學功能，故對糖肽進行糖苷鍵分析具有重要意義[17]。PSP和PSK的多糖部分含α-1,4和β-1,3糖苷鍵[2]。

目前對于糖苷鍵的研究，主要分為化學方法（高碘酸氧化、Smith 降解、甲基化分析等）[6，8，12]和儀器分析（飛行時間質譜）[17，21-22]兩類。

鄒巧根等[6]將云芝糖肽高碘酸氧化產物還原后酸水解，再鑒定水解產物，根據高碘酸的消耗量和甲酸的釋放量，從而推知云芝糖肽中可能含有1→4、1→6糖苷鍵，無1→3糖苷鍵。

鄒巧根等[6]對氫譜和碳譜（1HNMR和13CNMR）進行分析，表明云芝糖肽中含有α-糖苷鍵和β-糖苷鍵。Lin等[8]利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR） 的特征波數，提示PSP中含有β（1→3） 糖苷鍵。Jeong等[12]運用甲基化-GLC-MS技術，對云芝提取物進行糖苷鍵分析，測得1→4、1→6糖苷鍵和1→3糖苷鍵。

Rau等[22]將云芝糖肽經0.5 mol·L-1的TFA水解后，利用微流四級桿飛行時間質譜（μQTOF/MS）技術測定，表明云芝胞外多糖中1→4糖苷鍵或1→6糖苷鍵的存在。高效液相色譜-電噴霧離子化-四級桿飛行時間質譜（high performance liquid chromatography-electro-spray ionization-collision-Q-time-offlight mass spectrometer,HPLC-ESI-QTOF）[17]和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI-TOF）[21]技術也成熟應用于糖苷鍵的研究。

3.2 糖肽鍵分析

目前，蛋白質糖基化分析分為化學方法和質譜方法[6，23-25]。化學方法是指利用PNGaseF酶（N-糖肽）或β消除反應（O-糖肽）等方法將蛋白質和糖鏈解離后分別鑒定[24]。利用質譜方法進行完整糖肽分析可以更好地還原生物樣品的真實狀態。

鄒巧根等[6]對β-消除反應前后氨基酸分析結果顯示，絲氨酸和蘇氨酸的相對含量無明顯變化，說明云芝糖肽糖肽鍵的連接方式不是O-連接[23]。

完整糖肽質譜解析近年來多用于進行糖基化位點的確認、肽段序列分析以及糖鏈結構分析、蛋白質與糖鏈之間連接方式的分析[24]。其要求對糖肽片段進行富集，方法包括親水相互作用色譜（HILIC）、凝集素（lectin） 親和以及硼酸親和[25]。質譜檢測器一級和二級質量分析器均要有足夠寬的質量范圍；其次，低質量區的特征碎片離子是糖肽結構研究的重要參照，二級質譜質量分析器需要覆蓋低質量區的特征碎片離子質量數[24]。

4 立體結構研究

4.1 分子量

云芝糖肽的重均分子量在100 kDa左右，其分子量分布隨測定條件、發酵條件、提取工藝等因素而變化，不是一個絕對值[26]。目前絕大多數文獻采用分子排阻色潽法-示差折光檢測器（SEC-RI）[26]進行相對分子量的測定。該方法的原理為對照品右旋糖酐保留時間不隨流動相鹽濃度改變，但結合蛋白多糖的構型及分子形態大小受流動相中電解質（鹽）濃度的影響，故云芝糖肽的保留時間會隨之改變。從標準曲線上測得云芝糖肽主要組分的分子量大于50萬道爾頓。

也有文獻嘗試利用SEC-示差-激光光散射-黏度檢測器（SEC-RI-LLS-DP）[27]測定多糖的重均相對分子質量、回旋半徑及含量和多分散系數，或利用分子排阻色譜法-示差-激光光散射檢測器（SEC-RILLS）[28]進行絕對分子量的測定，可為云芝糖肽的絕對分子量測定提供參考。

4.2 糖肽蛋白結合態的研究

云芝糖肽中，多糖和蛋白質共價緊密結合，使PSP與云芝子實體多糖或菌絲體胞外多糖中存在非結合蛋白質/肽的混合體系區分開來[29]。多種方法可以驗證這一結合態，包括凝膠色譜法、二乙氨基乙基纖維素（DEAE）陰離子交換色譜法以及電泳法[6，9，29]。

楊曉彤等[30]利用凝膠色譜法將糖肽進行液相分離，洗脫液用示差檢測器和紫外檢測器串聯檢測，若示差檢測器（多糖響應）與紫外檢測器（蛋白質響應）同時出峰且峰位完全吻合，則認為糖肽處于緊密結合的狀態。

云芝糖肽國家藥品標準 [標準文號WS3-228（Z-047） -2003(Z)]的鑒定項目，主要采用二乙氨基乙基纖維素（DEAE）陰離子交換色譜法，分段收集洗脫液，分別加入茚三酮和苯酚-硫酸溶液進行驗證，鑒定糖肽聯結[9，29]。

鄒巧根等[6]將云芝糖肽經瓊脂糖凝膠電泳后，結果既呈現出多糖顯色特征又呈現蛋白顯色特征，而作為對照用的標準多糖樣品，只呈現出多糖的顯色特征，說明云芝糖肽中有結合態的蛋白。

5 結論

云芝糖肽作為商品化的免疫增強藥物和抗腫瘤藥物已經使用多年，通過對云芝糖肽的理化性質、化學成分、結構等進行了綜述，并對分析方法做出總結。隨著對云芝糖肽的研究的不斷深入，云芝糖肽的組成、結構和性質會被進一步揭示，統計學方法對復雜藥材成分的進一步歸納分析，從而提供對其生產加工各環節更有益的幫助，并對了解云芝糖肽的藥理作用提供了化學基礎。云芝糖肽必將會有更好的應用前景。