LC-MS/MS法測定蒸餾酒中環己基氨基磺酸鈉的不確定度評定

王文鵬，蘇美東，王 濤

（1.延安市食品質量安全檢驗檢測中心，陜西延安 716000；2.陜西省質量認證認可協會，陜西西安 710000）

不確定度的含義是指由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度。《檢驗檢測機構資質認定能力評價 檢驗檢測機構通用要求》（RB/T 214—2017）4.5.15要求檢驗檢測機構應根據需要建立和保持應用評定測量不確定度的程序[1]。環己基氨基磺酸鈉（Sodium N-cyclohexylsulfamate），俗稱甜蜜素，是一種常用甜味劑，其甜度是蔗糖的30～40倍[2]。其毒理學顯示：小鼠經口半數致死劑量為 18 g/kg，FAO/WHO（1982）規定每日允許攝入量為0～11 mg/kg[3]。我國《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）對食品中甜蜜素用量進行了嚴格限制，其中蒸餾酒中不得添加甜蜜素[4]。該研究工作在《食品安全國家標準 食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》（GB 5009.97—2016）[5]第3法液相色譜-質譜/質譜法為基礎上，參考相關文獻[6-11]，對蒸餾酒中環己基氨基磺酸鈉含量的不確定度進行評定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS8040三重四級桿液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI源），日本島津；渦旋混合器，IKA；電子天平（感量為0.001 g和0.01 mg），梅特勒。

環己基氨基磺酸鈉標準物質由壇墨質檢提供，純度99.9%；甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純。

1.2 試驗步驟與方法

按照國家標準《食品安全國家標準 食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》（GB 5009.97—2016）[5]。稱取酒樣10.0 g，置于50 mL燒杯中，于60 ℃水浴上加熱30 min，殘渣全部轉移至100 mL容量瓶中，用水定容并搖勻，經0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

1.3 標準溶液的配制

精確稱取0.118 21 g環己基氨基磺酸鈉標準品，用水溶解并定容至100 mL，混勻，溶液折算為環己基氨基磺酸1.052 mg/mL（環己基氨基磺酸鈉與環己基氨基磺酸的換算系數為0.890 9），作為標準儲備液。用水將1.00 mL標準儲備液定容至100 mL，濃度為10.52 μg/mL，作為標準中間液。

環己基氨基磺酸標準曲線系列工作液：分別吸取適量體積的標準中間液，用水稀釋，配成濃度分別為0.010 52 μg/mL、0.052 60 μg/mL、0.105 2 μg/mL、0.526 0 μg/mL、1.052 μg/mL 和 2.104 μg/mL 的系列標準工作溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：C18柱，粒徑1.7 μm，150 mm×2.1 mm（島津）；流動相：A為10 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序見GB 5009.97—2016第三法；流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI源）；檢測方式：多反應監測（MRM）；掃描方式：正負離子模式掃描；碰撞氣：氬氣；接口溫度：300 ℃；DL管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃。選擇的離子對參數見表1。

表1 定性、定量離子對和質譜分析參數

1.4.3 建立數學模型

結果計算如下：

其中：X-試樣中各待測組分的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；C-從標準工作曲線中讀出的供試品溶液中各待測組分的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V-試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；m-稱樣量，單位為克（g）。

2 結果與分析

2.1 不確定度的識別

由試驗方法、結果計算過程，可以看到不確定度的來源主要有樣品稱量、稀釋體積、標準溶液及其配制、校準曲線擬合、樣品測定等因素引入的不確定度。

2.2 樣品稱量的不確定度U1

稱取10 g的酒樣。所用天平檢定證書給出的最大允差為±1.0 mg，取均勻分布，則樣品稱量相對標準不確定度為：

2.3 樣品稀釋體積的不確定度U2

樣品稀釋體積的不確定主要來源于容量瓶中的校準、重復性的貢獻。其他如溫度、玻璃的膨脹系數所引起的不確定貢獻較小[8]。

20 ℃時100 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.10 mL，取均勻分布，其不確定度為：

取100 mL容量瓶重復充滿10次，稱量，其標準偏差為0.2 mL，重復性不確定度為：

因此樣品稀釋帶入的相對不確定度為：

2.4 標準溶液稀釋及配置不確定度U3

2.4.1 標準溶液引入的不確信度

查閱的環己基氨基磺酸鈉標準物質證書，其相對擴展不確定度均為0.5%，由于未顯示自由度，按矩形分布，則其相對不確定度Ustd：

所用所用天平檢定證書給出的最大允差為±0.02 mg，取均勻分布，則樣品稱量相對標準不確定度為：

2.4.2 標準溶液配制引入的不確定度

（2）10 μg/mL的標準工作液的配制引入的不確定度。配制時使用1 mL移液器分別吸取標準儲備溶液1 mL于100 mL的容量瓶，用水定容，配制成10 μg/mL混合溶液。此過程中使用100 mL容量瓶引入的不確定度為0.000 58。

1 mL移液器的校準證書顯示容量誤差為0.3%（k=2），其相對不確定度為：

則標準儲備液的不確定合成為：

2.4.3 標準曲線配制的不確定度

分別采用100 μL和1 mL移液器取標準中間液 0.01 μL、0.05 μL、0.1 μL、0.5 μL、1.0 μL 和2.0 μL至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。兩支移液器分別使用了3次。1 mL移液器引入不確定度見2.4.2（2），其使用了3次，則不確定度為0.001 2×3=0.003 6，同理 100 μL 不確定度為 0.005 5×3=0.016 5，10 mL容量瓶引入的不確定度為0.001 2，則標準曲線配制的不確定度為：

則標準溶液稀釋及配制不確定度為：

1.5 響應面試驗設計 通過單因素試驗確定各因素變量范圍，選擇提取溫度(A)、提取時間(B)及液料比(C)為主要影響因素。運用Design Expert 8.0軟件進行3因素3水平Box-Behnken試驗設計，試驗因素及水平編碼如表1所示。根據公式(1)計算出多元二次回歸數學模型，進行數據回歸分析。

2.5 標準曲線擬合引入的不確定度U4

標準曲線由6個質量濃度水平，分別是0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL 和2.0 μg/mL；每個質量濃度測定3次，樣品溶液測定6次，按照外標法擬合，測得環己基氨基磺酸的線性方程為Y=379 928X-35 038.67，相關系數R2=0.999 1，測得蒸餾酒樣品平均值濃度為0.976。

式中：p-樣品測定次數；n-標準溶液測定總次數；Ci-樣品平均質量濃度，μg/mL；C—-標準溶液平均質量濃度，μg/mL；Cj-各標準溶液質量濃度，μg/mL；Yj-各標準溶液濃度點的峰面積；A-校準曲線截距；B-校準曲線斜率。

計算所得：Sxx=10.06（μg/mL）2；Sy=9 427.3 μg/mL；U曲=0.013 34 μg/mL。

則由標準曲線引入的相對不確定度為：

2.6 樣品測定引入的不確定度

取樣品6份，按照標準規定制成溶液，測定6次，計算環己基氨基磺酸鈉（以環己基氨基磺酸計）的含量，結果見表2。環己基氨基磺酸鈉含量的平均值為9.49 mg/kg，樣品測定引入的不確定度可以用相對標準偏差來確定，為0.004 6。

表2 白酒樣品中環己基氨基磺酸鈉的含量

樣品測定的相對標準偏差為：

2.7 相對不確定度的合成

2.7.1 合成不確定度

根據各不確定度分量計算環己基氨基磺酸鈉（以環己基氨基磺酸計）測定值的合成相對不確定度U為：

2.7.2 擴展不確定度

取包含因子k=2（置信區間95%），白酒樣品中環己基氨基磺酸鈉（以環己基氨基磺酸計）的擴展不確定度計算為：

3 結論

白酒中環己基氨基磺酸鈉（以環己基氨基磺酸計）的測定結果為（9.49±0.428） mg/kg。通過對不確定度各分量的分析，可以得出標準溶液的配制和標準曲線是不確定度的主要來源，其次是樣品測定，其他分量貢獻較小，因此優化標準溶液配制方法和增加樣品測定次數是減小不確定度的有效途徑。