高效液相色譜法測定糧油食品中黃曲霉毒素含量

彭 立

（宜春市糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，江西宜春 336000）

黃曲霉與寄生曲霉等菌株在特定溫濕度條件下會產(chǎn)生黃曲霉毒素，屬于一類二級代謝產(chǎn)物，此類毒素對人體有強烈致癌危害。黃曲霉毒素包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中毒性最強的為黃曲霉毒素B1。由于自然環(huán)境中存在的黃曲霉毒素相對較多，且對人類的危害性極高，因此有必要做好相關(guān)的控制工作。目前，在檢測黃曲霉毒素時多選擇液相色譜法、金標(biāo)試紙法、酶聯(lián)免疫法及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中，高效液相色譜法具備極高的靈敏度和可觀的準(zhǔn)確性，能夠精確定量黃曲霉毒素，因此被廣泛應(yīng)用于食品中黃曲霉毒素的檢測。本文選擇免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)測定糧油食品中黃曲霉毒素B1。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜級）；乙酸銨（分析純）；0.22 μm微孔有機濾膜；黃曲霉毒素免疫親和柱；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 μg/mL）。實驗用糧油樣品獲取自近期本地市場抽樣。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（Agilent 1260）；電子天平（梅特勒ME204E型）；渦旋混合器（vortex genie2）；臺式高速離心機（TG16）。

1.3 實驗方法

1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液

精準(zhǔn)量取黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入適量甲醇稀釋為100 ng/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別量取 0.20 μL、2.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于樣品瓶內(nèi)，加入初始比例流動相定容，完成濃度分別為0.20 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。

1.3.3 樣品提取

精準(zhǔn)稱取5.00 g糧油樣品置于離心管（50 mL），加入甲醇-水溶液（70∶30）25.0 mL，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至超聲波儀內(nèi)持續(xù)20 min提取后，再持續(xù)10 min離心（6 000 r/min），收集上清液，待凈化。

1.3.4 樣品凈化

精準(zhǔn)量取上清液5.0 mL，加入含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液20 mL并混勻，待免疫親和柱原有液體恢復(fù)至室溫并流進后，用注射器裝載上述樣液，控制下滴流速為1.0 mL/min，全部下滴后用水淋洗免疫親和柱（分2次，共計耗水20 mL）[1-2]。待滴完水后抽干免疫親和柱，用甲醇洗脫免疫親和柱（分2次，共計使用甲醇2 mL），控制下滴流速為1.0 mL/min，用氮吹管裝載收集的洗脫液，50 ℃下氮氣吹干后，殘渣用初始比例流動相（1 mL）溶解后，過0.22 μm微孔有機濾膜并轉(zhuǎn)移至進樣小瓶內(nèi)，待測。

1.3.5 色譜條件

選 擇 Shim-pack GIST C18色 譜 柱，100 mm×2.1 mm，2 μm；40 ℃柱溫，0.3 mL/min柱流量，10 μL進樣體積[3]。流動相A、B分別為乙酸銨溶液（5 mmol/L）、乙腈-甲醇溶液（50∶50）.表1為梯度洗脫程序。

表1 流動相梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程及相關(guān)性

根據(jù)1.3.1和1.3.2的步驟完成標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，檢測不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照對應(yīng)化合物濃度（X）和目標(biāo)化合物響應(yīng)峰面積（Y）獲取黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845，線性范圍為0.2～20 ng/mL，R＞0.998。

2.2 方法檢出限

精準(zhǔn)量取適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，移至空白樣品溶液內(nèi)，加入初始流動相逐級稀釋，以檢出限為信噪比S/N=3為根據(jù)，通過計算獲取0.07 μg/kg的黃曲霉毒素B1檢出限，以定量限為信噪比S/N=10為根據(jù)，通過計算獲取0.2 μg/kg的黃曲霉毒素B1定量限。

2.3 加標(biāo)回收率及重現(xiàn)性

分別精準(zhǔn)稱取空白糧油樣品5.00 g，共計18份，圍繞1 ng/mL、4 ng/mL、15 ng/mL的水平對標(biāo)準(zhǔn)儲備分別進行6次加標(biāo)，通過處理檢測后得到黃曲霉毒素B1加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。加標(biāo)回收率超過85.0%，RSD處于2.8%～5.5%，見表2。

表2 加標(biāo)回收實驗（n=6）

2.4 實際樣品測定

為對該方法實用性與可靠性展開驗證，參照上述實驗方法對2種能力驗證樣品及3種市場糧油制品進行前處理后，獲取黃曲霉毒素B1含量測定結(jié)果，見表3。根據(jù)兩種能力驗證樣品中測定的黃曲霉毒素B1含量結(jié)果得知，Z比分?jǐn)?shù)為-0.83，|Z|≤2，結(jié)果滿意，證實了該方法的準(zhǔn)確性。以《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中有關(guān)谷物及其制品、油脂及其制品中規(guī)定的黃曲霉毒素 B1為 5.0～ 20 μg/kg、10～ 20 μg/kg的安全限量為根據(jù)，市場糧油制品測定結(jié)果中的黃曲霉毒素B1含量與國家安全限量標(biāo)準(zhǔn)相符合。

表3 實際樣品測定結(jié)果

2.5 實驗驗證

經(jīng)提取、凈化后的糧油制品，結(jié)合高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1，獲取的結(jié)果與國家安全限量標(biāo)準(zhǔn)相符合，加標(biāo)回收率超過85.0%，RSD處于2.8%～5.5%。實際樣品檢測中，結(jié)果滿意，證實了方法準(zhǔn)確性。本實驗方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于快速檢測糧油制品中黃曲霉毒素B1。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測方法選擇

目前，可用于檢測黃曲霉毒素的方法有很多，如膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、薄層色譜法及免疫親和柱-溴化熒光分光光度法等。其中，由于薄層色譜法會消耗大量溶劑，且重現(xiàn)性不太可觀，因此在檢測黃曲霉毒素中并不太適用[4]。膠體金試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法一般在快速篩查黃曲霉毒素中應(yīng)用，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法能夠同時檢測多種真菌毒素，然而因本身需要使用過于昂貴的儀器，會產(chǎn)生較高的使用成本，故而也不太適用。免疫親和柱無需消耗太多有機溶劑，且特異性強、機制干擾少、靈敏度高，在多種復(fù)雜基質(zhì)樣品中適用，在精確定量及確認(rèn)黃曲霉毒素中十分適用[5]。因此，本試驗在綜合對比多種方法的優(yōu)劣后，最終選擇了免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)對糧油食品中的黃曲霉毒素B1展開測定。

3.2 樣品前處理優(yōu)化

實驗室檢測樣品中黃曲霉毒素時，在樣品前處理方面多以手動凈化的方式為主[6]。但是該凈化方式涉及了過于煩瑣的過程，且會消耗大量時間，每天能夠完成的樣本處理量較少，面對較大樣品量時會暴露出人為因素影響大、時效性低等不足。而通過免疫親和柱在線凈化高效液相色譜法的應(yīng)用，能將上述不足有效彌補，大幅提升檢測時效性，且能為檢測結(jié)果提供準(zhǔn)確性保障。

3.3 流動相選擇

以標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016中洗脫程序為根據(jù)，以甲醇-乙腈和水、乙腈-水、甲醇-乙腈和0.5 mmol/L乙酸銨溶液為對象，對比流動相組合洗脫效果[7]。其中，甲醇-乙腈洗脫效率更顯著，洗脫時間更短。通過乙酸銨溶液的添加，能獲取對稱性良好的峰型，出峰時間更穩(wěn)定，單個樣品測試時間更短。因此，在綜合對比多種流動相的優(yōu)劣后，本實驗中確定流動相為甲醇-乙腈（50∶50）溶液和乙酸銨溶液（0.5 mmol/L）。

3.4 提取劑選擇

本次實驗前對提取劑選擇甲醇-水溶液和乙腈-水溶液時的提取效果展開對比分析，分析得到兩者之間不存在明顯差異，確定提取劑為成本相對更低的甲醇-水[8]。