HPLC-加校正因子自身對照法測定谷胱甘肽有關(guān)物質(zhì)*

王福堅,黃孟秋,黃子健,陳新陽,蔣 能

(1 廣州白云山明興制藥有限公司，廣東 廣州 510250；2 廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，廣東 廣州 510130；3 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530021)

谷胱甘肽(γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酰，glutathione)，存在于所有動物細(xì)胞中，正常環(huán)境下以其硫醇還原型(GSH)存在，是細(xì)胞內(nèi)主要的非蛋白質(zhì)巰基化合物。對GSH的藥理學(xué)研究結(jié)果表明[1-5]，GSH具有神經(jīng)保護(hù)作用，抗驚厥、癲癇發(fā)作及鎮(zhèn)痛作用，血管保護(hù)作用(包括抗高血壓作用、抗血栓作用和抗動脈粥樣硬化)，抗HIV作用，抗腫瘤和化療保護(hù)作用，聽力保護(hù)作用，抗炎等。林彤慧等[6]基于《美國藥典》中方法，通過調(diào)節(jié)流動相pH，進(jìn)行梯度洗脫，開發(fā)了一種高效液相色譜法用于測定谷胱甘肽中有關(guān)物質(zhì)。為了更好控制谷胱甘肽的質(zhì)量，本方法綜合各國藥典和文獻(xiàn)后，開發(fā)了一種新的高效液相色譜法用于測定谷胱甘肽中有關(guān)物質(zhì)，該方法高效、準(zhǔn)確，能夠滿足谷胱甘肽中有關(guān)物質(zhì)的測定。谷胱甘肽和雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱如圖1 所示，后文中出現(xiàn)的雜質(zhì)以其字母代替。

圖1 谷胱甘肽和雜質(zhì)A、B、C和D結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of glutathione and its impurities A, B, C and D

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；色譜柱C184.6×150 mm，5.0 μm，華譜；FE28型 pH 計，瑞士Mettler Toledo 公司；XPE105 十萬分之一天平，瑞士Mettler Toledo 公司。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鉀(色譜級)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；庚烷磺酸鈉(色譜級)，南京化學(xué)試劑有限公司；磷酸(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜級)， Merck公司；谷胱甘肽(批號130904)，浙江海正藥業(yè)股份有限公司；谷胱甘肽對照品(批號140706-200702)，中國藥品生物制品檢定所；雜質(zhì)A對照品，批號P140320-MY069435，上海紫域生物科技有限公司；雜質(zhì)B對照品，批號MKBG4156V，Sigma-aldrich；雜質(zhì)C對照品(批號L130424)，阿拉丁；雜質(zhì)D對照品(批號P140320-MY352072)，上海紫域生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

(1) 流動相配制：稱取稱磷酸二氫鉀6.80 g；庚烷磺酸鈉2.02 g，加水1000 mL溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至(2.8±0.05)。量取磷酸二氫鉀-庚烷磺酸鈉溶液970 mL；量取甲醇30 mL；以上兩溶液混合，過濾，脫氣，即得。

(2)供試品溶液配制：精密稱定谷胱甘肽原料約12.5 mg，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中約含0.5 mg的溶液，過濾，作為供試品溶液。

(3) 對照品配制：精密量取供試品溶液2 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為對照溶液。

(4) 樣品儲備液配制：精密稱取雜質(zhì)A、B、C 及D對照品各約10 mg，分別至4個10 mL 容量瓶中，加流動相溶解后稀釋至刻度，搖勻，分別作約為1 mg/mL的方法開發(fā)用雜質(zhì)A、B、C 及D 對照品溶液。

(5)系統(tǒng)適用性溶液：精密稱取谷胱甘肽約10 mg，置 10 mL容量瓶中，分別精密移取上述雜質(zhì)A、B、C 及D 對照品溶液各1 mL 后，加溶劑稀釋至刻度，搖勻即得谷胱甘肽約為1.0 mg/mL，雜質(zhì)A、B、C 及D 約為100 μg/mL的溶液，過濾，作為系統(tǒng)適用性溶液。

(6)色譜條件：華譜色譜柱C184.6×150 mm，5.0 μm，流動相流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測器為DAD 檢測器(二極管陣列檢測器) ，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

按照“2. 6”條色譜條件，取“2. 5”條系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣并分析，色譜圖見圖2，理論塔板數(shù)按谷胱甘肽計算不低于6000，主藥與雜質(zhì)及各個雜質(zhì)之間的分離度均大于2.0。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液色圖譜Fig.2 Chromatograms of System Applicability

2.2 專屬性試驗

按照“2. 2”供試品溶液的配置濃度，分別按要求配置專屬性考察混合對照溶液、酸破壞供試品溶液、堿破壞供試品溶液、氧化破壞供試品溶液、光照破壞供試品溶液、高溫破壞供試品溶液，按“2. 6”條色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，谷胱甘肽在經(jīng)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、熱及光照破壞主要產(chǎn)生雜質(zhì)A、雜質(zhì)B以及未知雜質(zhì)；經(jīng)氧化破壞主要使雜質(zhì)C增加，也產(chǎn)生未知雜質(zhì)。各破壞性試驗產(chǎn)生的降解產(chǎn)物與主峰在該色譜條件下分離度均符合要求；且主峰峰純度符合要求，該方法專屬性良好。

表1 谷胱甘肽和雜質(zhì)A、B、C、D的線性回歸方程、校下因子、檢測限、定量限、Table 1 Standard curves,correction factor, LODs and LOQs of glutathione and its impurities A, B, C, D

2.3 檢出限、定量限、校正因子、線性方程和范圍

對于谷胱甘肽和已知雜質(zhì)雜質(zhì)A、B、C 與D，檢測限(LOD)和定量限(LOQ)是根據(jù)信噪比法來確定的。將已知濃度的雜質(zhì)貯備液稀釋到低濃度的試樣，逐步稀釋后按分析方法測出的信號與空白處的信號(基線噪音)進(jìn)行比較， 當(dāng)信噪比 S/N=10 時，為谷胱甘肽、雜質(zhì)A、B、C 與D 的定量限和當(dāng)信噪比S/N=3時，為谷胱甘肽、雜質(zhì)A、B、C 與D 的檢測限，結(jié)果見表1。在定量限濃度至不低于指標(biāo)濃度150%的范圍內(nèi)取5個濃度點進(jìn)行研究。線性關(guān)系以測得的響應(yīng)信號(峰面積)對被分析物濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，具有良好的線性關(guān)系r，并確定校下因子f，結(jié)果見表1。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

2.4.1 精密度

按分析方法項下方法，分別進(jìn)樣6次系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，記錄色譜圖，雜質(zhì)A、B、C 與D峰面積的RSD值分別為0.1%、0.1%、0.6%、0.5%。結(jié)果表明，方法精密度良好。

2.4.2 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度是通過配制雜質(zhì)A、B、C 與D限度溶液80%，100%，120%三個指標(biāo)不同濃度樣品溶液測得的平均回收率為99.74%、101.22%、101.17%、101.62%。結(jié)果表明，該方法測定雜質(zhì)A、B、C 與D準(zhǔn)確度均良好。

2.5 耐用性試驗

分別調(diào)節(jié)流速為0.8、1.0和1.2 mL/min；柱溫25 ℃、 30 ℃和 35 ℃；pH 2.6、2.7、2.8、2.9、3.0時進(jìn)行系統(tǒng)耐用性試驗，結(jié)果表明，當(dāng)流速、流動相pH和柱溫發(fā)生微小變化時，各雜質(zhì)與主峰間的分離度符合要求；試驗表明，該方法耐用性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

在2 h內(nèi)，供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積沒有明顯變化；供試品溶液放置2 h后，產(chǎn)生雜質(zhì)A，雜質(zhì)C和未知雜質(zhì)的含量明顯增加，雜質(zhì)D的含量在供試品溶液放置16小時后明顯增加。因此，供試品溶液應(yīng)臨用新配。

2.7 供試品有關(guān)物質(zhì)測定

取本品3 批，按照項下中供試品配制方法，按照分析測試項下方法進(jìn)行測定，雜質(zhì)A、B、C、D其他單個最大雜質(zhì)與總雜質(zhì)以自身對照法測定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，3 批還原型谷胱甘肽有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果均符合要求。

表2 谷胱甘肽有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果Table 2 Test results of the impurities of glutathione (%)

3 結(jié) 論

谷胱甘肽及其雜質(zhì)A、B、C、D均為氨基酸類兩性有機(jī)物，分子極性較大，C18固定相中的保留較弱，一般要通過特殊的色譜柱和梯度洗脫才能將其有效分離。本方法通過流動相中加入離子對試劑庚烷磺酸鈉與谷胱甘肽及其雜質(zhì)A、B、C、D形成離子對；同時調(diào)節(jié)流動相pH值抑制其羧基解離，增長保留時間；使用普通C18色譜柱和等度洗脫獲得較好的分離度。該方法樣品處理便捷、專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可為谷胱甘肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供技術(shù)支持。