蜂毒組成分析方法的研究*

王彩肖，任風(fēng)芝，陳若塵，張向彬，張 彥，高彩杰，劉建芬，李麗紅

(1 華北制藥華坤河北生物技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050000；2 華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050000)

蜂毒是工蜂毒腺分泌的一種具有芳香氣味的成分復(fù)雜的混合物，主要含有蛋白質(zhì)多肽類(lèi)、酶類(lèi)、生物胺類(lèi)和其它物質(zhì)，其中蜂毒肽約占蜂毒干重的50%，是蜂毒中主要功能物質(zhì)[1]。蜂毒具有豐富的生物活性物質(zhì)，是天然藥物開(kāi)發(fā)利用的良好資源，被廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等疾病的治療[2]，但因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜易引起藥物穩(wěn)定性的問(wèn)題[3]，因此需要采用不同的分析方法研究不同來(lái)源的蜂毒在蛋白多肽組成上的差異，以期為今后蜂毒的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)方法采用銀染的方法進(jìn)行分離[4]，銀染法分辨率高，可以識(shí)別0.5 mg/kg以上的不同蛋白，這樣可以準(zhǔn)確識(shí)別出不同的樣品中的蛋白分布。分子排阻色譜-高效液相色譜法(SEC-HPLC)可以定量蛋白質(zhì)的分布及純度，檢測(cè)靈敏度高、速度快[5-6]。質(zhì)譜分析具有高靈敏、高準(zhǔn)確、高通量特性，為蛋白質(zhì)學(xué)領(lǐng)域提供了高質(zhì)量的研究分析手段，目前已有報(bào)道應(yīng)用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析，證明高分辨質(zhì)譜有其強(qiáng)大的高分辨率和高性能，適用于肽段和蛋白質(zhì)的組學(xué)分析[7-8]。

本研究擬采用不同的分析手段，包括聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、分子排阻色譜-高效液相色譜法(SEC-HPLC)、高分辨率質(zhì)譜法(HRMS)分別對(duì)4個(gè)不同來(lái)源的粗蜂毒樣品進(jìn)行蛋白多肽組分的差異性分析，及利用高效液相色譜法(HPLC)分析其蜂毒肽含量的差異性，從而希望能為后期蜂毒的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

蜂毒，市售；12%預(yù)制膠，Invitrogen；Marker，Thermo；10×PBS，Sigma；銀染試劑盒，Thermo；乙腈(色譜純)，Honeywell；冰醋酸(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲酸(色譜純)，Merck；三氟乙酸(色譜純)，Honeywell；蜂毒肽標(biāo)準(zhǔn)品(≥97%，HPLC)，aladdin；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，自制。

表1 樣品信息Table 1 The sample information

1.1.2 儀器與設(shè)備

PowerPac Basic Power Supply1645050電泳儀，美國(guó)Bio-Rad；e2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters；LC-2030C Plus高效液相色譜儀，日本島津；高分辨率質(zhì)譜儀(QE)，美國(guó)Thermo，超純水機(jī)，美國(guó)Pall。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SDS-PAGE方法

實(shí)驗(yàn)采用12%的預(yù)制膠，60 V的電壓進(jìn)行電泳，上樣量為25 μL，電泳結(jié)束后選擇銀染色法進(jìn)行固定、染色與脫色。

樣品溶液：稱(chēng)取適量蜂毒，用1×PBS溶液溶解稀釋成 1.0 mg/mL的溶液。

1.2.2 SEC-HPLC方法

色譜柱：Shodex PROTEIN KW-802.5(8.0×300 mm， 5 μm)；流動(dòng)相：將乙腈、水與冰醋酸按300:400:200的比例混合，用濃氨水(25%～30%)調(diào)pH至3.0，然后用水稀釋至1000 mL；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：UV276 nm；進(jìn)樣量：100 μL。

樣品溶液：稱(chēng)取適量蜂毒，用水溶解稀釋成1.0 mg/mL的溶液。

1.2.3 HRMS方法

色譜條件：使用超高效液相色譜儀，色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18Column(2.1×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A-0.1%的甲酸水溶液，B-0.1%的甲酸乙腈溶液，梯度洗脫(0～2.5 min：10%B；2.5～5.5 min：10%～50%B； 5.5～12.5 min，50%～80%B；12.5～13 min，80%～10%B；13～15 min，10%B)；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214/254nm。

質(zhì)譜條件：使用高分辨質(zhì)譜儀，離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；噴霧電壓：3.5 kV；透鏡電壓：50 V；輔助氣體流速：5 L/min毛細(xì)管溫度：320 ℃；分辨率：70000；掃描范圍：200～2000 m/z。

樣品溶液：稱(chēng)取適量蜂毒，用水溶解稀釋成0.25 mg/mL的溶液。

1.2.4 HPLC方法

色譜柱：UniPS 5-300(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A-0.1%的三氟乙酸水溶液，B-0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脫(0～15 min：30%～50%B；15～20 min，50%～30%B)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

樣品溶液：稱(chēng)取適量蜂毒，用水溶解稀釋成1.0 mg/mL的溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE方法

SDS-PAGE是定性分析蛋白質(zhì)最常用的電泳方法，從樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果的電泳圖譜(圖1)中可以看出凝膠背景清晰，蛋白條帶分辨率高。

圖1 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE test results

由圖1可知，蜂毒蛋白質(zhì)的表達(dá)條帶較多，蛋白質(zhì)分子量在1.7～40 kDa之間在樣品中所占比例較大，是樣品中的主要成分，蜂毒各主條帶沒(méi)有明顯差異；在分子量大于40 kD范圍內(nèi)，不同蜂毒中呈現(xiàn)出不同的蛋白條帶結(jié)果，這表明不同來(lái)源的蜂毒在蛋白組成上存在差異性，可對(duì)存在差異性的目標(biāo)成分進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，為今后蜂毒的開(kāi)發(fā)及藥用研究奠定基礎(chǔ)。

2.2 SEC-HPLC方法

通過(guò)SEC-HPLC測(cè)定蜂毒的組分差異性，實(shí)驗(yàn)采用兩根串聯(lián)的色譜柱(Shodex PROTEIN KW-802.5，8.0×300 mm， 5 μm)，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。

圖2 SEC-HPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.2 SEC-HPLC test results

表2 SEC-HPLC結(jié)果匯總Table 2 Summary of SEC-HPLC results

蜂毒樣品在20～40 min內(nèi)，有5個(gè)肽類(lèi)成分得到良好的分離，其中峰5為蜂毒肽I單體，以峰面積占比作為主要特征峰標(biāo)準(zhǔn)。由表2和圖2可知，不同來(lái)源的蜂毒比較，高分子蛋白的含量與分布在1、2、4的位置上明顯差異，這表明蜂毒樣品之間組成成分存在明顯差異，因此，高分子蛋白的方法可用于后期樣品的研究工作中。

2.3 HRMS方法

實(shí)驗(yàn)采用HRMS方法對(duì)不同蜂毒進(jìn)行分析，對(duì)樣品中有關(guān)物質(zhì)的分子量進(jìn)行分析，確認(rèn)樣品差異性，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。

圖3 HRMS方法結(jié)果圖譜(TIC圖)Fig.3 Results of HRMS method (TIC diagram)

表3 HRMS結(jié)果匯總Table 3 Summary of HRMS results

從圖3和表3中可知，蜂毒的成分復(fù)雜，主峰位于RT6. 16～6.42 min內(nèi)，為蜂毒肽單體，其分子量為2845.8 Da。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在RT 5.43～5.60 min區(qū)間內(nèi)，蜂毒-1，2，3樣品中的多聚體(分子量為16132.5 Da)明顯多于蜂毒-4(2021004)；RT 6.53 min左右，各個(gè)樣品中的分子量分布明顯不同，這也表明蜂毒樣品之間組成成分存在明顯差異，可作為后續(xù)對(duì)蜂毒樣品分析研究的依據(jù)。

2.4 HPLC方法

實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法對(duì)不同蜂毒樣品中的主成分蜂毒肽的含量進(jìn)行分析，確認(rèn)樣品差異性，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4和表4。

圖4 HPLC方法結(jié)果圖譜Fig.4 Results of HPLC method

表4 蜂毒肽含量結(jié)果匯總Table 4 Summary of melittin content results

本實(shí)驗(yàn)利用HPLC法，對(duì)4個(gè)蜂毒樣品中蜂毒肽的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，來(lái)源不同的蜂毒樣品中的蜂毒肽含量存在明顯差異。蜂毒肽是蜂毒中的主要成分，根據(jù)蜂毒肽的含量可以為后期蜂毒樣品質(zhì)量性研究及為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)蜂毒產(chǎn)品提供分析依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究運(yùn)用SDS-PAGE、SEC-HPLC和HRMS技術(shù)對(duì)蜂毒中的蛋白多肽組分的差異性進(jìn)行了一些基礎(chǔ)分析，及利用HPLC技術(shù)對(duì)蜂毒肽含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示這些分析方法可以檢測(cè)出蜂毒中蛋白多肽分子的差異性，可用于后期的深入研究中。由于蜂毒的化學(xué)成分體系非常復(fù)雜，其質(zhì)量可能會(huì)受多種因素的影響，如物種來(lái)源、養(yǎng)殖環(huán)境、采集方法等，而且蜂毒原料與臨床應(yīng)用上的用藥功效及安全性都有著緊密的聯(lián)系，為了保證蜂毒及其相關(guān)制劑在臨床上的穩(wěn)定性和安全有效性，因此，有必要選擇合適的分析方法用于研究蜂毒的組分差異性，為今后蜂毒的質(zhì)量分析及開(kāi)發(fā)利用等方面提供技術(shù)支撐。