MiR-151a-3p在酒精相關(guān)性肝癌中作用機制的研究

焦文鵬，焦文靜，郭秀娟，馮軍花，張金艷*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放一科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050011)

肝癌是常見惡性腫瘤，發(fā)病率占癌癥發(fā)病率第六位[1]。肝癌的主要誘因為病毒性肝炎，但隨著人們生活方式的改變，酒精相關(guān)性肝癌已占有肝癌發(fā)病的30%[2-5]。盡管采用多種治療模式，肝癌的5年生存率仍僅為34%～50%[6-7]。早期診斷和治療是改善預(yù)后的主要方式[8-9]。筆者回顧我院于2015—2019年收治的酒精相關(guān)性肝癌患者，發(fā)現(xiàn)部分患者可不經(jīng)歷肝硬化階段直接進(jìn)展為肝癌。尋找酒精性肝炎直接進(jìn)展為肝癌的標(biāo)志物可以提高此類患者的早期診斷。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是近年來常用的腫瘤標(biāo)志物，其可與目標(biāo)mRNA結(jié)合，調(diào)節(jié)下游途徑[10-11]。本研究旨在研究miR-151a-3p在酒精性肝炎直接進(jìn)展為肝癌中的作用機制，報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月1日—2019年12月31日我院收治的且經(jīng)病理證實為肝細(xì)胞癌的酒精相關(guān)性肝癌患者64例的病歷資料。其中男性58例，女性6例；年齡≥60歲34例，<60歲30例。根據(jù)篩選出的病歷信息，于病理科隨機選取5例酒精性肝炎/肝癌患者穿刺組織蠟塊，并根據(jù)性別和年齡配對原則，再隨機選取5例酒精性肝炎/肝硬化患者穿刺組織蠟塊，比較其miR-151a-3p表達(dá)水平。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞系 肝癌細(xì)胞系HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B和肝正常細(xì)胞系HL-7702從中國細(xì)胞系資源基礎(chǔ)設(shè)施獲得，由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院保留和培養(yǎng)，將所有細(xì)胞置于具有10%胎牛血清(Gibco，美國)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)中培養(yǎng)。

1.2.2福爾馬林固定石蠟包埋組織提取總miRNA miR特異性福爾馬林固定石蠟包埋試劑盒購自比利時Qiagen分支機構(gòu)。按照試劑說明進(jìn)行以下操作：①將蠟塊分別切成5 μm、10 μm、20 μm、30 μm、40 μm厚。根據(jù)組織的大小，將2～16片置于無RNA酶的EP試管中，向EP試管中加入1 mL二甲苯，劇烈搖動10 s，在20 ℃以14 000 r/min的速度離心2 min，丟棄上清液，根據(jù)石蠟的含量重復(fù)上述步驟1～3次。②加入1 mL的無水乙醇，搖勻并混合，以14 000 r/min的速度離心2 min，丟棄上清液。③風(fēng)干，加入240 μL蛋白激酶D緩沖液和10 L蛋白酶K，搖勻并混合，根據(jù)組織溶解情況在55 ℃孵育15 min，1、12、24、36、48 h。若組織不溶解時，于24 h加入10 L蛋白酶K，繼續(xù)孵育12～24 h，后在80 ℃孵育15 min。④加入500 L 紅細(xì)胞裂解緩沖液，搖勻并混合，將所有液體轉(zhuǎn)移至gDNA消除柱離心管中，以10 000 r/min的速度離心30 s，棄去離心管，保存上清液。⑤加入1.2 mL的無水乙醇，充分混合，將700 μL混合液轉(zhuǎn)移至miR特異性試劑盒最小洗脫液離心管，以1 000 r/min的速度離心15 s，棄去上清液，重復(fù)上述過程至所有樣品均離心。⑥加入500 L 藻紅蛋白緩沖液，以1 000 r/min的速度離心15 s，棄去上清液，重復(fù)以上步驟，但第二次離心2 min。⑦將miR特異性試劑盒最小洗脫液離心管放入新的收集管中，以14 000 r/min的速度離心5 min，棄去上清液。⑧將miR特異性試劑盒最小洗脫液離心管置于RNA收集管中，加入30 L的無RNase離心14 000 r/min，持續(xù)1 min，以溶解總RNA(包括miRNA)，使用紫外可見分光光度計測試質(zhì)量和濃度。以上實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.2.3CCK-8實 準(zhǔn)備90 μL肝癌細(xì)胞懸液，計數(shù)3×103個/孔，接種于96孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，向每個孔中添加10 μLLCCK-8增強溶液。于48 h和72 h時，在450 nm波長處測量吸光度(A)值，繪制曲線。以上實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.2.4實時定量RT-PCR RNA提取方法提取細(xì)胞總RNA(“細(xì)胞總”，指的是細(xì)胞的所有RNA)，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行操作，qPCR反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環(huán)和72 ℃ 1 min，數(shù)據(jù)表示為倍數(shù)差，基于2-△△Ct的計算。以上實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞儀測定 將肝癌細(xì)胞以1×107個/L的密度接種于6孔板中。 培養(yǎng)24 h后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。以上實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.2.6蛋白印跡分析 提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，孵育第一抗體過夜，并孵育第二抗體4 h，以增強化學(xué)發(fā)光超敏發(fā)光液發(fā)展。以上實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.2.7在肝癌細(xì)胞系中敲除miR-151a-3p 將肝癌細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并用慢病毒(si-miR-151a-3p)轉(zhuǎn)導(dǎo)24 h。于48 h使用0.8 mg/L嘌呤霉素進(jìn)行選擇，直至平行實驗的所有親代細(xì)胞死亡，剩余活細(xì)胞是具有敲低的miR-151a-3p的穩(wěn)定的HCC細(xì)胞系。本研究中使用的敲除miR-151a-3p的序列是5′-CUAGACUGAAGCUCCUUGAG-G-3′(GeneChem，中國上海)。被miR-151a-3p擊倒的穩(wěn)定細(xì)胞系即為si-miR-151a-3p。以上實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.2.8熒光素酶報告實驗 預(yù)測ATM的3′-非翻譯區(qū)序列與miR-151a-3p相互作用，或合成預(yù)測的靶位點內(nèi)的突變序列并將其插入pGL3對照熒光素酶報道載體(Promega，美國威斯康星州)。后產(chǎn)生pGL3-ATM-Wt和pGL3-ATM-Mut載體。將miR-151a-3p模擬物、pGL3、pGL3-ATM-Mut、pGL3-ATM-Wt質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞48 h。隨后裂解細(xì)胞，通過熒光素酶檢測試劑盒(Promega)分別測定熒光素酶活性。以上實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，采用Fisher精確概率法確定miRNA與患者信息變量之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1酒精性肝癌患者的一般資料 所有酒精相關(guān)性肝癌患者均由病理證實為肝細(xì)胞癌，且除外感染病毒性肝炎。其中，酒精性肝炎經(jīng)酒精性肝硬化最終進(jìn)展為肝癌44例；酒精性肝炎未經(jīng)歷肝硬化階段直接進(jìn)展為肝癌20例。酒精性肝炎/肝癌患者年齡較酒精性肝炎/肝硬化/肝癌患者年輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同進(jìn)展過程酒精相關(guān)性肝癌患者臨床比較Table 1 Clinical comparison of patients with alcohol-related liver cancer in different progression stages (例數(shù))

2.2兩組患者癌組織中miR-151a-3p表達(dá)水平比較 酒精性肝炎/肝癌患者癌組織中miR-151a-3p表達(dá)水平2.377±0.441顯著高于酒精性肝炎/肝硬化患者肝組織1.146±0.299，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.989，P=0.002)。

2.3肝癌細(xì)胞系中miR-151a-3p表達(dá)水平升高 評估m(xù)iR-151a-3p在4種肝癌細(xì)胞系和1種正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果表明miR-151a-3p 在4種常見肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于正常肝細(xì)胞系。而在肝癌細(xì)胞系中，HepG2中的表達(dá)最高。見表2。

表2 miR-151a-3p在不同肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)水平Table 2 The expression level of miR-151a-3p in different liver cancer cell lines and normal liver cell lines

2.4下調(diào)miR-151a-3p的影響 下調(diào)HepG2和Bel-7402中miR-151a-3p的表達(dá)水平，Si-miR-151a-3p(HepG2)細(xì)胞系和Si-miR-151a-3p(Bel-7402)細(xì)胞系中G0/G1期的細(xì)胞百分比明顯增加，而 S期和G2/M期的細(xì)胞明顯減少。見表3，4。

表3 HepG2細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞與其下調(diào)miR-151a-3p表達(dá)后miR-151a-3p表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of miR-151a-3p expression levels in HepG2 cells and Bel-7402 cells and those after down-regulation of miR-151a-3p expression cells

表4 Bel-7402細(xì)胞與其下調(diào)miR-151a-3p表達(dá)后miR-151a-3p表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of miR-151a-3p expression levels in Bel-7402 cells and those after down-regulation of miR-151a-3p expression cells

2.5下調(diào)miR-151a-3p抑制細(xì)胞周期的機制 與HepG2比較，Si-miR-151a-3p(HepG2)細(xì)胞中ATM的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，P53的mRNA表達(dá)水平增加，P-P53蛋白的表達(dá)水平增加，而Cyclin D1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同樣，與Bel-7402相比，Si-miR-151a-3p(Bel-7402)細(xì)胞中ATM的mRNA表達(dá)水平顯著增加，P53的mRNA表達(dá)水平顯著增加，而Cyclin D1的mRNA的表達(dá)水平顯著下降。見表5～8。

表5 HepG2細(xì)胞系A(chǔ)TM 、P53、Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平Table 5 The mRNA expression levels of ATM, P53, and Cyclin D1 in HepG2 cell lines

表6 Bel-7402細(xì)胞系A(chǔ)TM 、P53、Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平Table 6 The mRNA expression levels of ATM, P53, and Cyclin D1 in Bel-7402 cell lines

表7 HepG2細(xì)胞系A(chǔ)TM 、P53、Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平Table 7 The protein expression levels of ATM, P53, and Cyclin D1 in HepG2 cell lines

表8 Bel-7402細(xì)胞系A(chǔ)TM 、P53、Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平Table 8 The protein expression levels of ATM, P53, and Cyclin D1 in Bel-7402 cell lines

2.6miR-151a-3p調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的機制 熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞系和Bel-7402細(xì)胞系中，相應(yīng)的ATM-Mut構(gòu)建體不再被miR-151a-3p抑制，表明miR-151a-3p是直接靶向ATM-WT的miRNA。見圖2、表9，10。

圖1 ATM RNA的假定的miR-151a-3p結(jié)合序列

表9 qRT-PCR檢測HepG2細(xì)胞系和Si-miR-151a-3p(HepG2)中ATM基因表達(dá)水平Table 9 qRT-PCR detection of ATM gene expression level in HepG2 cell lines and Si-miR-151a-3p(HepG2)cell lines

表10 qRT-PCR檢測Bel-7402細(xì)胞系和Si-miR-151a-3p(Bel-7402)中ATM基因表達(dá)水平Table 10 qRT-PCR detection of ATM gene expression level in Bel-7402 cell lines and Si-miR-151a-3p(Bel-7402)cell lines

3 討 論

大量長期飲酒對人體的DNA、蛋白質(zhì)造成永久性損傷，增加促炎細(xì)胞因子釋放，減少抗腫瘤細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞招募，從而促進(jìn)免疫反應(yīng)的抑制，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[12]。研究酒精性肝炎進(jìn)展至肝癌的過程，有助于實現(xiàn)肝癌的早期診斷和治療。本研究于我院病案室篩選住院治療且經(jīng)病理證實為肝細(xì)胞癌的酒精相關(guān)性肝癌患者64例，其中44例為酒精性肝炎經(jīng)酒精性肝硬化，最終進(jìn)展為肝癌；20例為酒精性肝炎，未經(jīng)歷肝硬化階段，直接進(jìn)展為肝癌。對比臨床病歷特征，酒精性肝炎/肝癌患者年齡較酒精性肝炎/肝硬化/肝癌患者年輕。這說明其可能經(jīng)歷了不同的進(jìn)展過程。

本研究對比5例酒精性肝炎/肝癌患者組織和5例酒精性肝炎/肝硬化患者組織中10種相關(guān)miRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，酒精性肝炎/肝癌患者組織中miR-151a-3p的表達(dá)水平顯著高于酒精性肝炎/肝硬化患者。因此，筆者認(rèn)為miR-151a-3p可能在酒精性肝炎直接進(jìn)展為肝癌的發(fā)病過程中起到重要作用。

為了進(jìn)一步探討miR-151a-3p在酒精相關(guān)性肝癌中的作用，本研究進(jìn)行了體外實驗。首先，驗證miR-151a-3p在肝癌組織中的表達(dá)水平。在4種常見的HCC細(xì)胞系和1種肝正常細(xì)胞系中檢測miR-151a-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-151a-3p在4種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著高于肝正常細(xì)胞系，且在HepG2中的表達(dá)水平最高。本研究在2種肝癌細(xì)胞系中驗證miR-151a-3p的作用機制。在HepG2和Bel-7402中通過慢病毒下調(diào)miR-151a-3p表達(dá)水平，結(jié)果顯示，Si-miR-151a-3p(HepG2和Bel-7402)細(xì)胞系G0/G1期的細(xì)胞百分比顯著增加，而 S期和G2/M期的細(xì)胞明顯減少。實驗結(jié)果表明miR-151a-3p可以通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生與發(fā)展。但其具體機制尚需進(jìn)一步探索。

Liu等[13]研究顯示，miR-151a-3p可以通過抑制p53來促進(jìn)鼻咽癌的增殖，遷移和侵襲。因此，本研究使用qRT-PCR和蛋白印跡分析檢測與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，在Si-miR-151a-3p(HepG2和Bel-7402)細(xì)胞系中，ATM的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，P53的mRNA表達(dá)水平顯著增加，P-P53蛋白的表達(dá)水平顯著增加，而Cyclin D1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下降。共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張突變是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通常被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子[14-15]。ATM被激活以磷酸化不同細(xì)胞周期中的不同靶蛋白。P53是ATM基因的下游基因，是細(xì)胞信號通路的重要組成部分，主要在抑制細(xì)胞癌中發(fā)揮作用[16]。 P53抗腫瘤作用最重要的方法是阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-19]。此外，本研究構(gòu)建了熒光素酶報告分子，顯示相應(yīng)的ATM-Mut構(gòu)建體不再受到miR-151a-3p的抑制，說明miR-151a-3p可以通過直接靶向ATM從而抑制其表達(dá)。本研究顯示miR-151a-3p在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)，通過直接靶向ATM抑制P53，從而促進(jìn)cyclin D1的表達(dá)，導(dǎo)致肝癌的進(jìn)展。

綜上所述，部分酒精性肝炎患者可以不經(jīng)過肝硬化階段而直接進(jìn)展為肝癌。miR-151a-3p在其中扮演重要角色，通過直接靶向ATM抑制P53，從而促進(jìn)Cyclin D1的表達(dá)，導(dǎo)致肝癌發(fā)生、發(fā)展。