不同劑量甲潑尼龍對肺炎支原體肺炎模型小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路的影響

張俊光，張書麗，張會英，蘇艷文

(1.冀中能源峰峰集團有限公司總醫院兒科，河北 邯鄲 056200；2.冀中能源峰峰集團有限公司總醫院產科，河北 邯鄲 056200)

肺炎支原體肺炎主要是由肺炎支原體引發的肺部急性炎癥病變，是兒童中較為常見的肺部疾傳染病，能夠通過呼吸道進行傳染，在人群較多的地方，傳染率更是高達50%[1]。其主要能夠對氣道上皮細胞產生黏附作用，造成氧化應激損傷，同時釋放CARDS毒素，使氣道出現損傷[2]。近年來，隨著自然環境的不斷變化，使得該病發病率呈上升趨勢[3]。該病作為較強的傳染性疾病，臨床癥狀較為多變，隨著炎癥反應的不斷加重，不僅會影響到患者呼吸系統，同時易引發腦炎、腎炎及心肌炎等多種疾病[4]。同時，隨著病情的加重，可導致多系統功能障礙的出現[5]。甲潑尼龍屬于中效的糖皮質激素，其主要作用有穩定細胞膜、促進抗炎、抑制炎癥因子的釋放[6]。甲潑尼龍應用在肺組織損傷中取得顯著效果，但通過建立小鼠模型治療肺炎支原體肺炎涉及肺組織通路機制的研究，目前尚未見報道?，F基于肺炎支原體肺炎模型，分析不同劑量甲潑尼龍應用中對小鼠肺組織Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子κB(nuclear factor κB ，NF-κB)通路的影響，旨在為臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性小鼠，由吉林大學動物實驗中心提供，年齡7～10月，平均(8.5±0.8)月；體重220～234 g，平均(226.9±4.7) g。在環境中相對濕度為50%～55%、溫度在(24.1±2.1)℃，對小鼠進行喂養1周，光照時間在12 h/d。

本研究實驗動物倫理委員會所批準通過。

實驗試劑、甲潑尼龍(NV 公司)；兔抗小鼠白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體(Hyclone公司)；小鼠抗小鼠TLR4、NF-κB抗體(Gibco公司)；小鼠抗小鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(malondialdehyde,MDA)抗體(Sigma公司)；小鼠抗兔腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(Invitrogen公司)；正置熒光顯微鏡(日本Olympas公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 參照蒙艷麗等[7]相關建肺炎支原體模型文獻，隨機選取10只小鼠作為正常小鼠組，進行滴鼻0.1 mL蒸餾水。其余30只建立肺炎支原體肺炎小鼠模型，以乙醚對全部小鼠進行輕度麻醉，后使用1 mL注射器對小鼠鼻腔進行緩慢滴入1×107CCU/mL的MP菌液0.1 mL，并連續滴鼻3 d。在造模9 d后，采集小鼠血液進行分離培養及PCR檢測肺炎支原體，確認成功建立肺炎支原體模型。其中隨機選取10只小鼠為模型組，不做任何處理。其余20只進行甲潑尼龍，分別為低劑量干預組、高劑量干預組。參照宋立成等[8]相關不同劑量甲潑尼龍干預方法對大鼠進行干預，低劑量干預組對小鼠腹腔內進行注射0.4 mg/kg，高劑量干預組于小鼠腹腔內進行注射4 mg/kg。

1.2.2標本制備 取各組小鼠尾部靜脈血2 mL,2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80 ℃環境中保存待檢。對各組小鼠進行麻醉處理后，斷頭法處死，取小鼠頸動脈組織，之后固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規石蠟包埋及連續切片。

1.2.3HE染色 首先將切片烤干，后進行脫蠟處理，按照順序置入不同濃度的酒精中各進行復水3 min。選擇應用蘇木精進行15 min染色，然后清洗3次，以鹽酸酒精分化進行30 s處理，將其充分清洗后，以1%伊紅染色，酒精脫水處理，后脫蠟處理，待封片之后，顯微鏡觀察。

1.2.4TLR4、NF-κB表達檢測 將大鼠均抽取靜脈血，并放置在無添加劑真空試管中，在室溫下靜置30 min，將血液充分凝結。后在低速離心機內，以4 ℃環境下進行2 000 r/min轉速離心處理10 min，后以移液器移至1.5 mL無酶EP試管內，使用300 μL的EP管進行分裝，保存在-80 ℃冰箱中備用。以RT-PCR對TLR4、NF-κB表達進行檢測，首先提取細胞總RNA，檢測其RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得cDNA，設計引物序列，采用2-△△Ct方法計算TLR4、NF-κB表達，PCR引物以Primer Premier 6.0軟件進行設計(Invitrogen公司合成)。其中TLR4上引物為5′-TGGTTTACACGTCCA-TCGGT-3′,下游引物為5′-ATCAATGGTCACA-TCACATAGTCC-3′。NF-κB上引物為5′-AAAA-TGCCCCACGGTTATG-3′,下游引物為5′-ATTC-CTTTGCCTCC-3′。

1.2.5TLR4、NF-κB檢測 取小鼠肺部組織進行研磨，采用蛋白裂解液提取總蛋白，以免疫組化法檢測TLR4、NF-κB水平，以PBS作為陰性對照，當細胞膜或細胞漿呈棕黃色或棕褐色為CK19染色陽性信號。將組織蠟塊進行石蠟切塊，將厚度切為4 μm，以常規脫蠟、脫水，進行抗原修復，除去離子水孵化，并滴加TLR4、NF-κB為一抗，在4 ℃置放12 h，進行2次PBS清洗，同時滴加聚合梅輔助劑，在37 ℃下水浴，進行持續孵化，時間為20 min；2次PBS清洗，并進行滴加IgG多聚體。在37 ℃下水浴，進行持續孵化，時間為30 min。后計算出TLR4、NF-κB水平。

1.2.6TNF-α、IL-1β水平檢測 使用酶聯免疫法檢測TNF-α、IL-1β水平，首先將血清置于室溫后，標記酶標板，制作標準品，然后取出試劑盒，選擇1∶2稀釋液對樣品稀釋；在反應孔上選擇將稀釋好的待測血清和標準品100 μL/孔依次加入，在恒溫孵育箱中進行濕育2 h，溫度為37 ℃；以專用的洗滌液對反應板進行3次清洗，后置入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)，以100 μL/孔，在37 ℃恒溫孵育箱內進行濕育45 min；待繼續4次清洗反應板后，將反應孔中放入TMB溶液，規格為100 μL/孔，放置在37 ℃恒溫孵育箱中進行濕育45 min，后在反應孔中加入終止液100 μL/孔進行終止反應，以450 nm波長測定吸光度，顏色反應深淺與TNF-α、IL-1β水平成正比，經繪制標準曲線計算TNF-α、IL-1β水平。

1.2.7SOD檢測 應用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，首先取用聚苯乙烯試管，并分為測量管、對照管。提取樣品后，于上清中加蒸餾水，體積是上清的10倍，將樣品配制為濃度1%。測量管、對照管內均加1.0 mL試劑盒中的試劑，在試劑1、2、3、4內各加入0.1 mL，然后測量管加入樣品50 μL，在對照管內加50 μL蒸餾水，待加樣后，將試管放入旋渦混勻器進行充分混勻，在37 ℃恒溫水浴箱中存40 min。顯色：在對照管、測量管中各加2 mL顯色劑，室溫放置10 min。使用蒸餾水調零分光光度計算，選擇1 cm光徑條件下，以波長550 nm比色。

1.2.8MDA檢測 取用聚苯乙烯試管，將其分為標準管、標準空白管及測量管、測量空白管，分別在標準管中加入10 nmol/L四乙氧基丙烷0.1 mL與試劑盒試劑，標準空白管加0.1 mL的無水乙醇與試劑，測量管加入肌肉組織勻漿0.1 mL的上清液與試劑，測量空白管加肌肉組織勻漿0.1 mL的上清液與試劑。加樣完畢后，搖動試管架將其混勻，標準管、標準空白管、測量管均置入3 mL的硫代巴比妥酸與1 mL的雙蒸水，測量空白管內置入硫代巴比妥酸3 mL與50%冰醋酸 1 mL。所有試管置入旋渦混勻器混勻，將試管口使用用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺出一個小孔，在95 ℃進行水浴40 min，使用后流水進行冷卻，然后在4 ℃，以3 500～4 000 r/min離心處理10 min，將上清液使用移液器吸取，加入比色皿內待檢，使用蒸餾水調零分光光度計算出MDA值。

1.3統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析檢驗、SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HE染色 正常小鼠組肺泡及支氣管結構清晰且完整，且未出現肺泡間隔增厚及炎性細胞侵襲；模型組肺泡出現融合、破裂，氣管和肺間質被較多淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤；低劑量干預組肺泡及支氣管結構完整，出現炎性細胞浸潤以及少量分泌物；高劑量干預組肺泡及支氣管結構得到改善較為顯著(圖1)。

圖1 各組間小鼠肺組織病理學變化(HE ×200)

2.2各組TLR4、NF-κB表達比較 各組間小鼠TLR4、NF-κB表達進行比較，相比正常小鼠組，模型組、低劑量干預組與高劑量干預組TLR4、NF-κB表達均較高，低劑量干預組與高劑量干預組TLR4、NF-κB表達低于模型組，且高劑量干預組TLR4、NF-κB表達低于低劑量干預組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組TLR4、NF-κB表達比較Table 1 Comparison of the expression of TLR4 and NF-κB among groups

2.3TLR4、NF-κB水平比較 相比正常小鼠組，模型組、低劑量干預組與高劑量干預組TLR4、NF-κB水平均較高，低劑量干預組與高劑量干預組TLR4、NF-κB水平低于模型組，且高劑量干預組TLR4、NF-κB水平低于低劑量干預組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組間TLR4、NF-κB水平比較Table 2 Comparison of TLR4 and NF-κB levels among groups

2.4TNF-α、IL-1β水平比較 相比正常小鼠組，模型組、低劑量干預組與高劑量干預組TNF-α、IL-1β水平均較高，低劑量干預組與高劑量干預組TNF-α、IL-1β水平低于模型組，且高劑量干預組TNF-α、IL-1β水平低于低劑量干預組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組間小鼠TNF-α、LI-1β水平進行比較Table 3 Comparison of the levels of TNF-α and LI-1β among groups

2.5MDA、SOD水平比較 相比正常小鼠組，模型組、低劑量干預組與高劑量干預組MDA水平較高、SOD水平均較低，低劑量干預組與高劑量干預組MDA水平低于、SOD水平高于模型組，且高劑量干預組MDA水平低于、SOD水平高于低劑量干預組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組間小鼠MDA、SOD水平進行比較Table 4 Comparison of the levels of MDA and SOD of mice in each group

3 討 論

當肺炎支原體造成肺部急性炎癥病變即肺炎支原體肺炎，是兒童人群中較為常見的一種肺炎，近年來其發病率有著明顯的升高的趨勢[8]。肺炎支原體肺炎具有較高的傳染性，主要通過呼吸道進行傳染，經血液流經全身[9]。在較多人群中，傳染率高達50%。在肺炎支原體肺炎中，當大量炎癥因子的釋放，進而使患者病情加重，病死率得到提升[10]。多數學者研究表明，TLR4/NF-κB是較為經典的信號傳導通路，在炎癥反應與氧化應激中均發揮重要作用[11]。TLR4能夠激活NF-κB進而使炎癥因子的釋放，當TLR4介導信號通路激發炎癥反應，進而造成炎癥與抗炎癥反應失衡及組織損傷。在肺炎中，糖皮質激素能夠有效抑制炎癥反應。甲潑尼龍屬于一類中效糖皮質激素，具有穩定細胞膜、抗炎及非特異性免疫抑制的作用[12]。能夠有效做到消除肺間質水腫，同時能夠減輕肺組織細胞的凋亡。

Toll樣受體作為一類的跨細胞膜受體蛋白。其能夠識別病原體相關分子模式，同時引發信號傳導，并使得炎癥介質釋放[13]。目前，在Toll樣受體中共發現13個，其中TLR4在單核細胞、巨噬細胞以及淋巴細胞等廣泛分布。在肺炎中，TLR4呈高表達狀態，當NF-κB被TLR4所激活，對組織造成嚴重損傷，是出現死亡的主要原因[14]。在炎癥反應與氧化應激中TLR4/NF-κB信號傳導通路過表達發揮重要作用。相關研究顯示，TLR4單克隆抗體能夠明顯減輕小鼠肺部損傷，通過干預TLR4信號通路，能夠有效減輕炎癥反應[15]。本研究結果顯示，應用甲潑尼龍對肺炎支原體肺炎模型小鼠進行干預，TLR4、NF-κB表達較低，且高劑量效果較為顯著，說明在肺炎支原體肺炎模型小鼠應用甲潑尼龍，抑制TLR4/NF-κB通路表達，顯著改善肺組織損傷。

在肺炎支原體肺炎中，炎癥反應在其中發揮重要作用。TNF-α能夠誘導并放大炎癥反應，當細胞接受到炎癥信號，TNF-α會迅速得到釋放[16]。相關研究顯示，當TNF-α初次釋放，能夠與其他炎癥細胞結合，進而啟動機體內免疫應激；當TNF-α再次釋放，正反饋放大炎癥反應，能夠促進其他炎癥因子的生成與釋放[17]。IL-1β屬于一類較為重要的促炎因子，能夠與IL-1RI受體結合，進一步造成NF-κB的下游活化[18]。同時能夠導致TNF-α分泌上升，進而誘導一系列炎癥相關分子的表達。相關研究顯示，通過對IL-1β信號傳導的阻斷，其他炎性因子的效應能夠有效得到改善[19]。本研究結果顯示，應用甲潑尼龍對肺炎支原體肺炎模型小鼠進行干預，TNF-α、IL-1β水平較低，且高劑量效果較為顯著，說明在肺炎支原體肺炎模型小鼠應用甲潑尼龍，抑制炎癥反應較為顯著。

氧化應激在疾病進展中發揮重要的作用。當機體被病原體入侵，能夠直接造成呼吸道上皮細胞與黏膜損傷，進而使氧自由基增多，能夠導致機體氧化/抗氧化出現失衡，進而引發氧化應激的發生[20]。SOD是生物體內較為主要的自由基清除劑，能夠使超氧陰離子歧化成過氧化氫，在氧化物水解酶作用下成為水分子，具有清除多種來源自由基，并對機體發揮保護的作用[21]。MDA屬于脂質過氧化物所分解的一種產物，其水平能夠反映機體細胞因自由基產生的損傷程度，對MDA相關測定能夠得知脂質過氧化水平[22]。本研究結果顯示，應用甲潑尼龍對肺炎支原體肺炎模型小鼠進行干預，MDA水平較低、SOD水平較高，且高劑量效果較為顯著，說明在肺炎支原體肺炎模型小鼠應用甲潑尼龍，顯著改善氧化應激。

綜上所述，在肺炎支原體肺炎模型小鼠中，應用甲潑尼龍能夠顯著改善出現的肺組織損傷，抑制TLR4/NF-κB通路表達，降低炎癥反應程度，改善氧化應激，且高劑量效果較為顯著。