p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p在腦出血中的表達及與病情嚴重程度相關性研究

朱澤，俞立峰，朱偉東

腦出血是由非外傷性腦實質內血管破裂導致的出血，具有較高的死亡率和發病率，其中17%～55%的患者為急性腦出血，成為威脅人類健康及生活質量的重大疾病之一。腦出血患者發病較為復雜，主要與腦血管的病變有關，與高血脂、糖尿病、高血壓、血管老化及吸煙等密切相關。患者常常在情緒激動、費勁用力時突然發病，1個月內病死率高達40%，幸存者中多數留下不同程度的運動障礙、認知障礙或語言吞咽障礙等后遺癥。神經營養因子受體p75（p75NTR）為腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，為跨膜蛋白。研究表明神經p75NTR可增加細胞凋亡，加重病情的發展[1]。LINGO-1屬于一種Nogo受體作用蛋白，主要存在于含亮氨酸重復系列和免疫球蛋白結構域中，對髓鞘形成、神經元活性具有重要作用[2]。血清微RNA-23a-3p（miR-23a-3p）是miRNA中的一員，廣泛調控機體各種生理和病理過程，在細胞分化中起重要作用[3]。本文分析p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p在腦出血中的表達及與病情嚴重程度的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省諸暨市中醫醫院2018年5月至2020年5月收治的腦出血患者132例（腦出血組），其中男63例，女69例；年齡50～72歲，平均（58.0±14.0）歲。另選本院健康人80例作為健康組，其中男42例，女38例；年齡50～75歲，平均（59.4±12.5）歲。兩組一般資料差異無統計學意義（均＞0.05）。本研究經本院倫理委員會審核批準，患者家屬均知情同意并簽署了知情同意書。

納入標準：符合腦出血診斷標準[4]，且經顱腦CT掃描證實有出血灶，患者神經功能發生缺損，伴有嘔吐、頭疼、血壓升高等癥狀。排除標準：伴有凝血功能障礙、感染性疾病者；心肺、肝腎等重要器官損傷；行激素、免疫抑制劑治療者；因顱內畸形導致的腦內出血者；蛛網膜下腔出血、出血性腦梗死者；患有感染性疾病者；既往有腦器質行疾病者。

1.2 方法

1.2.1 p75NTR、miR-23a-3p檢測 采集研究對象清晨空腹靜脈血8 ml，以離心半徑8cm，轉速3000r/min，進行10min離心處理，分離出上層血清，保存于－20℃冰箱中待用。采用Trizol法提取樣本RNA，使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得總cDNA，采用Primer 5.0軟件設計引物序列，啟動PCR儀，反應體系：0.4 l上下游引物、1 lcDNA模板、10 l SYBGreen，加蒸餾水至20 l。反應條件：95℃預變性1 s、95℃5 s、60℃31 s，共進行40個循環，采用2－△△Ct方法計算出p75NTR、miR-23a-3p表達量。p75NTR上 游 引 物 序 列：5’-AACAAGACCTCATAGCCAGCA-3’，下游引物序列：5’-CAGGATGGAGCAATAGACAGG-3’；miR-23a-3p 上 游 引 物 序 列：5’-GCGATCACATTGCCAGGG-3’，下游引物 序 列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；內參U6引物序列：上游：5’-CTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.2 LINGO-1檢測 收集研究對象空腹靜脈血8 ml，將其置于離心管中，以12000r/min離心5min，取上清，于－20℃保存。取50 g蛋白加入2×SDS凝膠緩沖液，在95～100℃中加熱5～15 min使蛋白變性。之后將分離的蛋白質轉膜、取模，4℃環境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間1 h，用封閉液稀釋一抗后加入洗滌液，待吸盡封閉液后加入稀釋好的一抗，緩慢搖動孵育1～2h后加入洗滌液，搖動5min，吸完后重復加入，洗滌5min 3次。吸進洗滌液后加入用封閉液稀釋好的二抗，緩慢搖動孵育1～2 h后加入洗滌液，再次連續洗膜5min 3次。定量分析蛋白表達情況，以GAPDH為內參。

1.2.3 嚴重程度評估 采用美國國立衛生研究院腦卒中評分量表（NIHSS）評估病情嚴重程度，重度：NIHSS＞15分，肌力為0～Ⅰ級，患者出現意識重度障礙。中度：NIHSS5～15分，肌力為Ⅱ～Ⅲ級，出現中度意識障礙。輕度：NIHSS1～4分，肌力在Ⅲ級以上，患者意識清楚。

1.3 統計方法 采用SPSS26.0統計軟件進行處理。計量資料以均數±標準差表達，多組比較采用方差分析，兩組比較采用獨立樣本 檢驗；危險因素分析采用二分類多因素Logistic回歸模型分析；相關性分析采用Pearson相關分析＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健康組和腦出血組p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比較腦出血組p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平高于健康組（均＜0.05），見表1。

表1 健康組和腦出血組p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比較

2.2 不同腦出血嚴重程度患者p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比較 重度腦出血患者32例，中度腦出血患者44例，輕度腦出血患者56例。隨著腦出血嚴重程度的加重，p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p的升高加劇（均＜0.05），重度腦出血＞中度腦出血＞輕度腦出血患者（均＜0.05）。見表2。

表2 不同腦出血嚴重程度患者p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比較

2.3 影響腦出血嚴重程度的多因素分析 將腦出血發生作為因變量，將p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p作為自變量，納入二分類多因素Logistic回歸模型分析，結果顯示p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p為影響腦出血嚴重程度的獨立危險因素（均＜0.05），見表3。

表3 影響腦出血嚴重程度的多因素分析

2.4 p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p之間相關性分析 p75NTR與LINGO-1呈正相關（=0.479＜0.05），p75NTR與miR-23a-3p呈正相關（=0.388，＜0.05），LINGO-1與miR-23a-3p呈正相關（=0.361＜0.05）。

3 討論

腦出血的發生是由腦血管病變引起的，當血流流入腦實質中，破壞腦實質正起血腦屏障破壞，影響患者預后[5]。

p75NTR屬于跨模型蛋白，在神經細胞的分化、生存、凋亡中發揮著重要作用，其與細胞凋零有關，可以使體外培養的雪旺氏細胞、運動神經元、感覺神經元和交感神經元發生凋亡，下調或阻斷p75NTR表達可以減少凋亡[6]。本研究結果顯示，腦出血發病后，p75NTR表達明顯升高，且隨著病情的發展表達加劇。這表示p75NTR與腦出血患者的病情、嚴重程度存在一定聯系。

LINGO-1是一種重要的跨膜蛋白、腦內神經再生抑制因子，可以負向調節少突膠質細胞分化、抑制神經元生長和髓鞘生成，其在神經干細胞成熟過程中調節神經元的凋亡[7]。研究表明，LINGO-1可以抑制軸突再生、少突膠質細胞分化和髓鞘形成、神經元存活[8]。本研究結果顯示，LINGO-1隨著腦出血的發生逐漸升高，且隨著病情的加重升高加劇。這表示LINGO-1與腦出血患者的病情、嚴重程度存在一定聯系。

miR-23a-3p是一種功能性miRNA，與多種炎癥疾病存在密切聯系[9-10]。miR-23a家族包括 miR-23a-5p和miR-23a-3p。miR-23a-3p在細胞的增殖、分化、凋亡等生物學活動中發揮著重要作用；此外，其在其他疾病治療中也發揮著重要作用。miR-23a-3p的異常表達與疾病的部分臨床特征有關，可以作為診斷相關疾病，預測疾病復發和預后的重要指標。本研究結果顯示，miR-23a-3p在腦出血患者體內升高，且隨著病情的加重逐漸升高。這表示miR-23a-3p與腦出血患者的病情、嚴重程度存在一定聯系。本研究還發現p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p三者間均呈正相關，提示著三者可能共同參與此病的發生進展，但本研究并未深入分析其具體作用機制，還需后續研究進一步分析驗證。