利用生物信息學(xué)技術(shù)探究動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的關(guān)鍵基因

林少沂，朱云云，姚麒

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 以“Atherosclerosis”為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。選擇了GSE41571和GSE120521表達(dá)芯片，均檢測(cè)頸動(dòng)脈斑塊mRNA表達(dá)譜，前者包括5個(gè)破裂斑塊樣品和6個(gè)穩(wěn)定斑塊樣品，后者包括4個(gè)破裂斑塊樣品和4個(gè)穩(wěn)定斑塊樣品。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載矩陣文件和芯片探針注釋文件。

1.2 方法 利用GE02R對(duì)GSE41571進(jìn)行差異基因表達(dá)值計(jì)算，選取校正后P＜0.05及I logFC（fold change）l＞2作為篩選閾值，得到DEGs。利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）對(duì)共有差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（GO）和信號(hào)通路（KEGG）富集分析。利用STRING10.5（https://stringdb.org）對(duì)共有差異表達(dá)基因編碼蛋白的相互作用進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置最低要求的相互作用分?jǐn)?shù)為0.9。利用Cytoscape_v3.8.2軟件插件Cytohubba尋找蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與不穩(wěn)定斑塊發(fā)生發(fā)展相關(guān)的核心模塊和關(guān)鍵基因，并分析核心模塊相關(guān)的生物學(xué)功能及關(guān)鍵基因表達(dá)與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因 篩選96個(gè)DEGs，與穩(wěn)定斑塊相比，破裂斑塊中有17個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，79個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（封三彩圖6）。

2.2 差異基因富集分析 GO包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組成三部分。GO和KEGG分析推測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性可能與這些基因功能或信號(hào)通路的改變有關(guān)。表達(dá)下調(diào)的差異基因：功能主要富集在細(xì)胞黏附、細(xì)胞基質(zhì)黏附、鈣離子結(jié)合和鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等，通路主要富集在調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路（表1）。表達(dá)上調(diào)的基因富集于免疫反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性及蛋白質(zhì)結(jié)合等。

表1 差異基因的GO和KEGG分析

2.3 編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（CPPI）構(gòu)建及分析 CPPI構(gòu)建得到了由93個(gè)節(jié)點(diǎn)、30條連線構(gòu)成的相互作用關(guān)系圖。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析得到了由3個(gè)共表達(dá)基因構(gòu)成的核心模塊，均為下調(diào)的差異表達(dá)基因（封三彩圖7）。MCC算法得到FZD7、ASPN、PAK3、STK38L、KIF3A、COL 21A 1、FAP、LCP2、HECW2、GLIS2 10個(gè)關(guān)鍵基因。

這10個(gè)在差異表達(dá)基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。除LCP2基因外，其余9個(gè)關(guān)鍵基因均為下調(diào)基因且同時(shí)存在于前面分析的核心模塊中。進(jìn)一步檢測(cè)GSE120521基因芯片中10個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)，破裂斑塊中FZD7、ASPN、PAK3、STK38L、KIF3A、COL21A1、FAP、HECW2及GLIS2減少，而LCP2增加（封四彩圖1～2）。

3 討論

斑塊穩(wěn)定性對(duì)AS臨床事件的發(fā)生至關(guān)重要，但其分子機(jī)制尚不清楚。本研究從GSE41571中篩選出96個(gè)DEGs，其中下調(diào)的79個(gè)DEGs功能主要富集在細(xì)胞黏附、細(xì)胞基質(zhì)黏附、鈣離子結(jié)合和鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等，通路主要富集于調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路。上調(diào)的17個(gè)DEGs富集于免疫反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性及蛋白質(zhì)結(jié)合等。

通過PPI與斑塊穩(wěn)定性相關(guān)的核心模塊初步探索，最終確定了10個(gè)關(guān)鍵基因。破裂斑塊中FZD7、ASPN、PAK3、STK38L、KIF3A、COL21A1、FAP、HECW2、GLIS2及LCP2的表達(dá)水平顯著改變。除LCP2表達(dá)上調(diào)外，其余9個(gè)基因在破裂斑塊中表達(dá)均降低。GSE120521上述10個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，與GSE41571一致。這些基因可能在斑塊的穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用。

FZD蛋白是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的Wnt受體家族，F(xiàn)ZD7是其中唯一可以激活Wnt通路每個(gè)分支（Wnt/-catenin途徑、Wnt/PCP途徑和Wnt/Ca2+途徑）的成員[1]。FZD7參與調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，敲除FZD7基因可以顯著抑制腫瘤血管新生[2]。ASPN是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可通過抑制Toll樣受體信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[3]。PAK3屬于P21活化的激酶家族，在細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞遷移、蛋白合成及細(xì)胞存活等生理過程中發(fā)揮重要作用[4]。STK38是NDR蛋白激酶家族的成員，進(jìn)化上高度保守，其活化后參與細(xì)胞周期、增殖、凋亡與自噬等多種生命活動(dòng)的調(diào)控，尤其在細(xì)胞周期中扮演著重要角色[5-7]。KIF3A是驅(qū)動(dòng)蛋白2家族成員，除了擁有驅(qū)動(dòng)蛋白的一些共性（調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，介導(dǎo)微管運(yùn)動(dòng)等）外，在增殖和遷移上亦有重要作用[8]。COL21A1編碼XXI型膠原的 鏈，維持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性。FAP蛋白參與控制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。HECW2作為膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）/Ret信號(hào)的調(diào)節(jié)因子，在血管生成中發(fā)揮重要作用。GLIS2是轉(zhuǎn)錄因子，已知參與Hedgehog通路刺激轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，該信號(hào)通路控制細(xì)胞增殖與分化。

唯一上調(diào)的基因LCP2編碼的蛋白是淋巴細(xì)胞胞漿蛋白2，作為T細(xì)胞抗原受體活化蛋白酪氨酸激酶途徑底物的銜接蛋白，是多種受體下游信號(hào)級(jí)聯(lián)的重要中間產(chǎn)物。LCP2調(diào)節(jié)免疫受體信號(hào)傳導(dǎo)（如T細(xì)胞受體），也是中性粒細(xì)胞和血小板中整合素信號(hào)傳導(dǎo)所必需的[9]，在介導(dǎo)白細(xì)胞黏附和激活中起重要作用[10]，提示斑塊破潰與炎癥和免疫密切相關(guān)。LCP2可能為預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和治療提供新的分子靶點(diǎn)。

本研究還存在一些局限性，樣本量較少，同時(shí)也導(dǎo)致相關(guān)GEO數(shù)據(jù)集中缺乏臨床特征數(shù)據(jù)，這些可能會(huì)影響某些亞組患者結(jié)果的準(zhǔn)確性。