腦利鈉肽基因啟動子甲基化與風濕性心臟病繼發肺動脈高壓患病風險的相關性

朱才民，李旎，邵國豐

肺動脈高壓（PAH）是一類以肺血管阻力進行性升高并伴隨著肺血管重塑為特點的少見并且致命性的疾病，其病理生理特征是由增殖的內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞組成的肺小動脈叢狀病變引起的閉塞性血管病變，導致肺動脈壓力持續升高，并且最高致使右心功能衰竭和死亡[1]。PAH分為原發性和繼發性，原發性肺動脈高壓（PPH）是目前原因不明的一類肺動脈高壓，屬致命性PAH，臨床較少見，包括特發性肺動脈高壓（IPAH）與家族性肺動脈高壓（FPAH）。繼發性肺動脈高壓可發生于重癥慢性肺部疾病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、先天性心臟病、心臟瓣膜病、風濕性心臟病及艾滋病等，除有肺動脈高壓的臨床表現外，還有原發病所呈現的表現[2]。研究顯示高度增殖的肺動脈平滑肌細胞（PASMC）中SOD2基因的表達水平下降，會引發氧化還原反應信號通路受損，且SOD2表達水平的下降主要是由于DNA甲基化轉移酶調控的SOD2啟動子區域CpG島DNA甲基化，引起SOD2基因轉錄抑制所致[3]。本研究旨在探討PAH致病B型腦利鈉肽（BNP）基因啟動子區域CpG島的DNA甲基化水平表達變化與PAH患病風險的關系，為PAH提供新一輪的治療方法，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017—2018年期間于寧波市李惠利醫院治療的風濕性心臟病合并PAH的患者60例為實驗組。排除標準：（1）先天性心臟病、梅毒性心瓣膜病、感染性心內膜炎、乳頭肌功能不全、腱索斷裂及粘液樣變性等所致的瓣膜損害；（2）精神疾病、聽力障礙或語言表達交流障礙；（3）合并基礎疾病，其他出血凝血疾病史，惡性腫瘤史；（4）孕產婦，HIV感染者。根據肺動脈壓力（PASP）分為輕度PAH（30 mmHg≤PASP＜50 mmHg，1 mmHg≈0.133 kPa）、中度PAH（50 mmHg≤PASP＜70 mmHg）及重度PAH（PASP≥70 mmHg）[4]3組，各20例。輕度組男10例，女10例；中位年齡50歲。中度組男10例，女01例；中位年齡48歲。重度組男10例，女10例；中位年齡53歲。另選取同期心肺功能正常的健康體檢者20例為對照組，男10例，女10例。本研究經醫學倫理委員會的同意簽署書面同意書。

1.2 試劑及儀器 基因組DNA抽提試劑盒（QIAGEN 51104），甲基化修飾試劑盒（QIAGEN），dNTP、TBE、6*Loading buffer購于上海捷蘭生物技術有限公司，Taq酶（KAPA），臺式高速離心機PICO 17、NANO-DROP（Thermo），BIORADPOWERPAC 3000、BIO RAD DNA SUB CELL（BIO RAD），凝膠成像系統GIS-1600購于上海天能科技有限公司，ABI 9700 PCR System（Applied Biosystems），Pyro-Mark Q96 ID（PyroMark Q96 ID）。

1.3 方法 提取血漿中DNA后利用亞硫酸鹽修飾反應進行甲基化修飾，再進一步純化亞硫酸鹽修飾的DNA，進行甲基化PCR，最后進行Pyrosequencing檢測。其中引物合成由PyroMark Assay Design 2.0設計，由華大基因合成。見表1。

表1 BNP引物

1.4 統計方法 采用GraphPad Prism軟件對實驗數據結果進行統計分析，計量資料均用均數±標準差表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

以PAH患者與正常對照組為研究對象，選取了5個位點，測定每個位點CpG島（pos.1～5）甲基化狀態。每個位點甲基化率見封三彩圖1。PAH組在pos.2、pos.4、pos.5位點與對照組差異均有統計學意義（均P＜0.05）。通過比較輕、中和重度PAH與對照組，中度、重度PAH組pos.4位點差異存在統計學意義（P＜0.05）。見封三彩圖2。

3 討論

BNP廣泛分布于心、肺、腦、脊髓等組織，但是在心臟中含量最高，故又稱其為心臟類激素。人類合成BNP的基因片段坐落于1號染色體的短臂上，與上游的心房利鈉肽（ANP）基因片段相連接，在ANP基因上游長度約為8kb的位置處，其中有3個外顯子和2個內含子參與BNP的基因前體的編碼，在轉錄成信使RNA（mRNA）時去除了2個內含子從而形成編碼134肽的成熟mRNA，翻譯后形成前腦利鈉肽（pre-BNP）。前腦利鈉肽在其分泌的過程中通過剪切去除信號肽后形成pre-BNP，這一過程是在心臟內前體剪切的，形成包含32個氨基酸殘基的成熟BNP及76個氨基酸殘基的成熟N端片段（NT-pro-BNP）。BNP主要表達作用于心室，然心室中BNP含量僅是心房的1%～2%，心室（特別是病理狀態下的心室細胞）是合成和分泌BNP的主要位置，而心房細胞發揮重要的儲藏作用。BNP在血管內發揮的作用主要是抑制平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖，從而在血管再重塑中和調節血壓的過程中起著關鍵的作用，與ANP相比，BNP是一個更好的反應心衰及左心室功能障礙標記物，因心肌擴張，BNP快速合成釋放于血液中可以幫助調節心臟功能[5-6]。另外，BNP還有利鈉利尿，抗醛固酮作用以及舒張血管和降低血壓的作用。在心血管疾病中，諸如充血性心力衰竭、高血壓、急性心肌梗死、心肌病和心肌肥厚等，BNP基因的表達及合成分泌較正常情況下均顯著增加。在一些研究顯示，血清中BNP的水平與中度PAH患者的平均肺動脈壓力呈正相關，其中敏感性及特異性均比較高[7]。Leuchte[8]和Goetze[9]等的研究顯示，血清BNP水平可用作一項無創的簡便可靠并且穩定的指標從而對肺部疾病中PAH的程度進行評價，并可以反映中度以上的PAH的程度。

脊椎動物中3種鈉尿肽基因已被證實來自于CNP-3基因的復制[10]。哺乳動物含有兩個這種基因，分別是Nppa和Nppb。在基因組中，它們各自相差幾Kbp的距離。BNP的上游基因存在大量的非編碼區。ANF和BNP的監管序列在這些位點中隨處可見，相距幾個到成百上千的Kbp距離。此外，考慮到表達模式非常相似和ANF與BNP產生的過度肥厚反應，這些基因可能共用同一個監管序列。類似的例子可以在諸如Irx基因和MHC基因的其他族群基因的表達監管中發現。ANF/BNP基因族群的調控元件可能通過轉錄因子和心臟組織特定組蛋白修飾共同的作用而被辨別[11-12]。

2016 年筆者團隊研究顯示風濕性心臟病患者BNP基因啟動子甲基化水平明顯高于對照組，并進一步闡明了長期服用華法林抗凝的瓣膜置換術后的患者BNP基因甲基化水平高于對照組，其他影響因素中，包括年齡，性別等均做了相應對照分析[13]。基于此，本實驗旨在研究風濕性心臟病患者中PAH對BNP基因啟動子甲基化水平的影響，結果表明PAH患者中BNP基因啟動子區域CpG島甲基化率相對正常人顯著增多，表明BNP基因甲基化在PAH發病機制中起到一定作用。尤其在PAH越高的情況下，BNP基因啟動子區域的CpG島甲基化率較正常對照組差異越明顯，其在pos.4位點發現中度PAH組和高度PAH組也存在統計學差異。這說明PAH患者隨著疾病的進展，BNP基因位點甲基化也逐步增多。在臨床上是否可以通過識別BNP基因甲基化位點，人工誘使其去甲基化是否對風濕性心臟病繼發肺動脈高壓患者的疾病轉歸提供幫助，待進一步實驗證實。