二氫苯并呋喃醇化合物體外抗衣原體活性研究*

石禹，包小峰，陸群，喬進(jìn)，劉凌燕

(1.南通大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室，南通 226006；2.南通大學(xué)藥學(xué)院，南通 226001；3.南開大學(xué)元素有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071)

衣原體是一類嚴(yán)格在真核細(xì)胞內(nèi)專性寄生生活的革蘭陰性病原體，它在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖呈現(xiàn)兩種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，稱為原體(elementary body，EB)和網(wǎng)狀體(reticular body，RB)，衣原體具有從EB到RB再到EB獨(dú)特的發(fā)育周期[1]。目前臨床上衣原體感染的治療主要依靠包括四環(huán)素類(如多西環(huán)素)、大環(huán)內(nèi)酯類(如阿奇霉素)等抗菌藥物[1]，雖然在大多情況下抗感染治療有效，但是耐藥現(xiàn)象同樣屢見不鮮，并且臨床上衣原體持續(xù)隱蔽感染和復(fù)發(fā)的病例日益增多[2-3]。目前，仍沒有可以投入臨床使用的新型抗衣原體藥物[4]，本文主要研究合成的二氫苯并呋喃醇衍生物的抗衣原體活性，分析其抗衣原體作用的機(jī)制，為尋找更好的抗衣原體化合物提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、衣原體及化合物 細(xì)胞：人宮頸癌細(xì)胞HeLa S3、人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2。衣原體：沙眼衣原體L2(CtL2)，接種于HeLa S3細(xì)胞37 ℃培養(yǎng)，肺炎衣原體AR39(CpnAR39)，接種于Hep-2細(xì)胞35 ℃培養(yǎng)。化合物：5個(gè)前期合成的二氫苯并呋喃醇類化合物由南開大學(xué)柳凌艷老師提供[5]，簡(jiǎn)稱為1-5，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，固體粉末溶于二甲亞砜(DMSO)配制成100 mmol·L-1儲(chǔ)存液，-20 ℃避光保存；實(shí)驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至需要的濃度。

圖1 化合物1-5的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2藥品與主要試劑 DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司(AC11018291)；胎牛血清購自美國Sigma公司(17D178)；PBS購自美國Hyclone公司(AF29485473)；細(xì)胞染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自武漢博士德生物工程有限公司(130307)；疊氮鈉購自青島雪潔助劑有限公司(404C051)；Na2HPO4、KH2PO4購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司(20130205)。四環(huán)素購自生工生物上海有限公司(200-593-8)潔助劑有限公司(404C051)本實(shí)驗(yàn)室自制的小鼠來源的抗鼠衣原體MoPn(C.muridarum strain Nigg II)抗血清用于檢測(cè)CtL2[6]，自制的小鼠來源的抗CpnAR39抗血清用于檢測(cè)CpnAR39[7](KHP2016073)，F(xiàn)ITC親和標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗夠自美國Sigma公司(SLBX2002)。

1.3免疫熒光染色實(shí)驗(yàn) 將HeLa S3細(xì)胞接種于放置了蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)過夜。按每孔感染復(fù)數(shù)(multiple of infection，MOI)0.2分別加入CtL2，并在感染的同時(shí)分別加入0.5，1，2，4，8，16 μmol·L-1的化合物，0.1% DMSO為陰性對(duì)照，11.25 μmol·L-1四環(huán)素為陽性對(duì)照[8]。在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，甲醇固定細(xì)胞，依次使用對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體和FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色，同時(shí)使用伊文思藍(lán)(Evans Blue)染色細(xì)胞質(zhì)，通過Olympus IX51熒光顯微鏡采用20×物鏡拍攝圖片。

1.4感染性子代滴度測(cè)定實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種到48孔板中，培養(yǎng)過夜后按上述方法感染衣原體并加入化合物。對(duì)于CpnAR39，需室溫900×g離心1 h以促進(jìn)其感染。在37 ℃(CtL2)或35 ℃(CpnAR39)培養(yǎng)36 h后，刮取細(xì)胞，并超聲裂解釋放子代衣原體。將裂解液按1：10連續(xù)稀釋后，再次感染96孔板中的細(xì)胞，36 h后同上方法進(jìn)行免疫熒光染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)包涵體的數(shù)量，并由此計(jì)算出每個(gè)樣品中的感染性子代的滴度值。最后，將各實(shí)驗(yàn)組的滴度值按(陰性對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/ 陰性對(duì)照組×100% 得到各實(shí)驗(yàn)組的抑制率，采用非線性回歸計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)值，并以平均值(95%置信區(qū)間)表示。

1.5細(xì)胞毒性測(cè)定實(shí)驗(yàn) 取生長狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞種于48孔板中，分別給予16 μmol·L-1化合物處理，對(duì)照組為0.1% DMSO。48 h后甲醇固定，Evans Blue染細(xì)胞形態(tài)(紅色)，DAPI染細(xì)胞核(藍(lán)色)。或者將上述化合物處理的細(xì)胞在48 h后用胰酶消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.6宿主細(xì)胞預(yù)處理實(shí)驗(yàn) 將16 μmol·L-1化合物與48孔板中的宿主細(xì)胞在37 ℃預(yù)孵育2 h，洗去化合物后按MOI 0.2加入CtL2感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后進(jìn)行免疫熒光染色，計(jì)數(shù)包涵體數(shù)量，包涵體的數(shù)量即反映感染進(jìn)入細(xì)胞的衣原體數(shù)量。

1.7衣原體預(yù)處理實(shí)驗(yàn) 將16 μmol·L-1化合物與CtL2 在4 ℃預(yù)孵育1 h，洗去化合物后按MOI 0.2加入CtL2感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后進(jìn)行免疫熒光染色，計(jì)數(shù)包涵體數(shù)量，包涵體的數(shù)量即反映感染進(jìn)入細(xì)胞的衣原體數(shù)量。

1.8后加藥實(shí)驗(yàn) 以MOI 0.2的CtL2感染過夜培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，而后分別在感染后0(即感染同時(shí)加入化合物，陽性組)2，12和24 h加入16 μmol·L-1化合物，繼續(xù)培養(yǎng)至36 h收獲細(xì)胞，測(cè)定感染性子代的滴度值。以感染但不給予化合物處理作對(duì)照組，將各組滴度值按(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組×100% 計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的抑制率。

1.9撤藥實(shí)驗(yàn) 以MOI 0.2的CtL2感染過夜培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，感染的同時(shí)即加入16 μmol·L-1化合物，而后分別在感染后2，12，24和36 h(即感染全程化合物處理，陽性組)洗去化合物，繼續(xù)培養(yǎng)至36 h收獲細(xì)胞，測(cè)定感染性子代的滴度值。以感染但不給予化合物處理作對(duì)照組，將各組滴度值按(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組×100% 計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的抑制率。

2 結(jié)果

2.1化合物對(duì)CtL2生長有抑制作用 免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖2)，隨著化合物處理濃度的增加，包涵體數(shù)量逐漸減少、大小也逐漸減小，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性關(guān)系。感染性子代滴度測(cè)定結(jié)果顯示(圖3)，化合物1—5對(duì)CtL2感染性子代也呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性抑制效果，該作用與免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)的直接抑制效果一致，由此得出二氫苯并呋喃醇類化合物1—5可以抑制CtL2的生長。化合物對(duì)CtL2感染性子代滴度的IC50值見表1，為4～6 μmol·L-1。

2.2化合物對(duì)CpnAR39生長也有抑制作用 感染性子代滴度測(cè)定結(jié)果顯示見圖4，化合物對(duì)CpnAR39感染性子代也都呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性抑制效果，其IC50值為4～8 μmol·L-1。結(jié)合CtL2結(jié)果可以得出二氫苯并呋喃醇類化合物1—5對(duì)衣原體的生長抑制作用具有廣譜性。對(duì)比表1中5個(gè)化合物的IC50值發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)CtL2 的抑制作用略強(qiáng)于CpnAR39。基于此，后面的機(jī)制探索將以CtL2為研究對(duì)象。

2.3化合物的抗衣原體活性與細(xì)胞毒性無關(guān) Evans Blue和DAPI染色結(jié)果顯示(圖5A)，與對(duì)照組相比，化合物處理48 h后的宿主細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核均沒有發(fā)生改變，表明在16 μmol·L-1(抗衣原體活性檢測(cè)中的最高濃度)時(shí)化合物處理不存在明顯的細(xì)胞毒性作用。活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果(圖5B)，與DMSO組相比化合物處理沒有改變細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步證明5個(gè)二氫苯并呋喃醇類化合物對(duì)宿主細(xì)胞沒有毒性作用。

2.4化合物對(duì)衣原體感染過程的影響 宿主細(xì)胞預(yù)處理實(shí)驗(yàn)顯示(圖6A)，化合物處理組的包涵體數(shù)量與對(duì)照組(0.1% DMSO)相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，說明宿主細(xì)胞的化合物預(yù)處理不會(huì)影響衣原體感染進(jìn)入細(xì)胞。衣原體預(yù)處理實(shí)驗(yàn)顯示(圖6B)，化合物處理組的包涵體數(shù)量與對(duì)照組相比也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，說明衣原體的化合物預(yù)處理也不會(huì)影響衣原體感染進(jìn)入細(xì)胞。綜上所述，本研究中的5個(gè)二氫苯并呋喃醇類化合物不影響衣原體的感染過程。

2.5化合物對(duì)衣原體增殖過程的影響 后加藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7A)，對(duì)化合物1，3，5來說，與陽性組相比，在感染2或12 h后加入對(duì)它們的抑制效果影響不大，只有在感染24 h后加入才會(huì)顯著降低它們的抑制作用，說明化合物1，3，5對(duì)衣原體的生長抑制主要作用于12 h以后的階段，即RB增殖和RB向EB轉(zhuǎn)化階段；對(duì)化合物2，4來說，與陽性組相比，在感染2 h后加入化合物就開始對(duì)它們的抑制效果產(chǎn)生影響，晚于12 h再加入化合物會(huì)極大影響它們的抑制能力，說明加入化合物時(shí)間越早則抑制效果越強(qiáng)，化合物2，4對(duì)衣原體的生長抑制需要全程的持續(xù)作用。

撤藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7B)，對(duì)所有化合物來說，與陽性組相比，在感染后2 h撤去化合物它們的抑制作用幾乎消失，說明它們的抑制作用不在感染后的0～2 h即EB進(jìn)入宿主細(xì)胞的階段，而在EB進(jìn)入宿主細(xì)胞之后的階段；對(duì)化合物1，3，5來說，與陽性組相比，在感染后12 h撤去化合物對(duì)它們的抑制作用影響不大，說明化合物1，3，5對(duì)衣原體生長的2～12 h即EB向RB轉(zhuǎn)化過程有很強(qiáng)的抑制作用；對(duì)化合物2，4來說，與陽性組相比，在感染后12 h撤去化合物對(duì)它們的抑制仍然影響很大，只有在感染24 h后撤去化合物才不會(huì)對(duì)它們的抑制作用產(chǎn)生影響，說明化合物撤去的越晚對(duì)它們的抑制作用影響越小，也進(jìn)一步表明化合物2，4對(duì)衣原體的生長抑制需要全程的持續(xù)作用。

3 討論

抗菌藥物一直是臨床上治療衣原體感染的首選藥物[9]，然而抗菌藥物耐藥、持續(xù)感染和復(fù)發(fā)等現(xiàn)象對(duì)抗菌藥物治療衣原體感染帶來了挑戰(zhàn)。在缺少有效抗衣原體疫苗的情況下，尋找新的抗衣原體化合物可能是一個(gè)解決問題的有效途徑[9]。

本研究以前期合成的5個(gè)二氫苯并呋喃醇類化合物為對(duì)象，報(bào)道了該類化合物的體外抗衣原體活性。5個(gè)化合物的抗衣原體活性具有廣譜性，對(duì)可導(dǎo)致性病淋巴肉芽腫的CtL2(圖1)和可引起肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病的CpnAR39(圖4)這兩個(gè)人源病原株都具有較好的抑制作用。另外它們對(duì)鼠衣原體MoPn也具有抑制作用，只是活性相對(duì)要弱一些，IC50值都在10 mmol·L-1以上。

圖2 免疫熒光染色代表圖

圖3 化合物對(duì)CtL2感染性子代滴度抑制率

表1 化合物1—5抑制CtL2和Cpn AR39的IC50值

圖4 化合物對(duì)Cpn AR39感染性子代滴度抑制率

衣原體是嚴(yán)格的宿主細(xì)胞內(nèi)寄生病原菌，宿主細(xì)胞的生長狀態(tài)也會(huì)影響衣原體的生長，為此本研究評(píng)估了化合物對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用。Evans Blue細(xì)胞形態(tài)染色、DAPI細(xì)胞核染色和活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)表明(圖5)，本研究中的5個(gè)二氫苯并呋喃醇類化合物對(duì)宿主細(xì)胞沒有毒性作用，這些結(jié)果證明了其抗衣原體活性與其宿主細(xì)胞毒性作用無關(guān)。

A.熒光染色代表圖，Evans Blue(紅色)，DAPI(藍(lán)色)；B.活細(xì)胞數(shù)量。

A.宿主細(xì)胞預(yù)處理實(shí)驗(yàn)；B.衣原體EBs預(yù)處理實(shí)驗(yàn)。

衣原體的生長發(fā)育具有獨(dú)特的EB和RB兩相發(fā)育周期，因此其生長發(fā)育過程可分為感染和增殖兩個(gè)階段。在感染階段，EB與宿主細(xì)胞接觸粘附后通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞[1]，本研究發(fā)現(xiàn)，將宿主細(xì)胞或EB分別與化合物預(yù)孵育均不能影響EB感染進(jìn)入細(xì)胞(圖6)，這些結(jié)果說明5個(gè)二氫苯并呋喃醇類化合物的抗衣原體作用不涉及衣原體的感染過程。對(duì)于CtL2來說，一般情況下感染宿主細(xì)胞后的0～2 h主要是EB粘附、進(jìn)入細(xì)胞的過程，2～12 h主要是EB→RB的轉(zhuǎn)化過程，12～24 h主要是RB→RB的復(fù)制(即RB增殖)過程，24～36 h主要是RB→EB的轉(zhuǎn)化過程[1]，為此，筆者設(shè)計(jì)了后加藥和撤藥實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析了化合物對(duì)衣原體不同發(fā)育階段的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在衣原體感染宿主細(xì)胞2 h后就去除化合物，這5個(gè)化合物的抗衣原體作用幾乎消失(圖7B)，說明僅有0～2 h的化合物作用不能抑制衣原體生長，表明5個(gè)二氫苯并呋喃醇類化合物對(duì)衣原體感染進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程沒有影響，這一結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了宿主細(xì)胞或EB預(yù)處理的結(jié)果(圖6)。對(duì)于化合物1，3，5在感染后12 h再加入對(duì)它們的抑制效果影響不大(圖7A)，如果改成感染時(shí)即加入而后在12 h撤去同樣對(duì)它們的抑制效果影響不大(圖5B)，這些結(jié)果表明化合物1，3，5對(duì)衣原體的增殖全過程都具有很強(qiáng)的抑制作用，可以抑制EB→RB的轉(zhuǎn)化過程、RB→RB的增殖過程和RB→EB的轉(zhuǎn)化過程。對(duì)于化合物2，4來說，在感染后2 h加入就會(huì)削弱它們的抗衣原體效果，晚于12 h則影響極大(圖7A)，如果改成感染時(shí)即加入化合物則早于24 h撤去同樣對(duì)其抑制效果影響很大(圖7B)，這些結(jié)果表明化合物2，4對(duì)衣原體增殖的過程抑制作用較弱，并且需要全程的持續(xù)作用，作用的時(shí)間越長效果越強(qiáng)。

A.后加藥實(shí)驗(yàn)；B.撤藥實(shí)驗(yàn)。

四環(huán)素類(主要是多西環(huán)素)作為衣原體感染的臨床首選藥物，四環(huán)素抑制CtL2的IC50值約為20 nmol·L-1[7]，而二氫苯并呋喃醇類化合物的IC50值約為5 mmol·L-1，活性差距較大。盡管如此，本研究報(bào)道了二氫苯并呋喃醇類化合物的抗衣原體活性，可作為先導(dǎo)化合物為今后研究其衍生物的抗衣原體活性奠定基礎(chǔ)，將有助于推動(dòng)新型抗衣原體藥物開發(fā)的進(jìn)程[10]。