外泌體源性miRNA在肺癌侵襲和轉移中的作用機制

詹日明，唐旭東,b

(廣東醫科大學 a.生物化學與分子生物學研究所，b.抗腫瘤活性物質研發協同創新中心，廣東 湛江 524023)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，同時也是全世界癌癥死亡的主要原因，但肺癌的病因及發展機制目前尚未明確。近年來，我國的肺癌發病率和病死率均呈快速增長趨勢，肺癌患者的預后也不理想[1]。肺癌早期癥狀不明顯，且發展迅速，易出現遠處轉移，因此尋找特異性高的早期診斷標志物和療效更好的治療方法迫在眉睫。外泌體中富含多種生物活性物質(包括核酸、蛋白質、脂質等)，可介導細胞間物質和信息傳遞，參與蛋白質和RNA的轉運、抗原呈遞以及免疫應答等生理和病理過程[2-3]。外泌體來源的微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一種長約22 nt的非編碼內源性小RNA，可在轉錄后水平負性調節基因的表達，進而影響細胞的生長、增殖和轉移等[4-5]。外泌體源性miRNA并非被動釋放，而是響應機體特定刺激下的選擇性分泌。有證據表明，外泌體源性miRNA在肺癌外泌體源性信息調控網絡中占據重要地位，參與肺癌的血管生成、上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、腫瘤微環境的重編程、免疫調節及腫瘤細胞間耐藥性的傳遞，在調控肺癌的侵襲和轉移中發揮重要作用[6-7]。現就外泌體源性miRNA在肺癌侵襲和轉移中的作用機制予以綜述。

1 外泌體源性miRNA概述

1983年，外泌體首次在綿羊網織紅細胞中被發現[8]，1987年，Johnstone等[9]將其命名為“Exosome”。外泌體是活細胞分泌的直徑為30～100 nm的囊狀小泡，外部由雙層脂膜構成，內部包裹著細胞分泌的各種信息物質(如蛋白質、脂質、信使RNA、miRNA)，具有發展為高效藥物載體和基因治療制劑的潛力[10]。1993年，Lee等[11]首次在秀麗隱桿線蟲發現miRNA。隨后，研究發現，miRNA可通過與目標信使RNA的3′非翻譯區或開放閱讀框區域結合介導轉錄后基因沉默，參與調控細胞的發生、發展[12-13]。作為臨床檢測指標，外泌體源性miRNA便于取材，易于篩檢。Nik Mohamed Kamal等[14]研究發現，血清和唾液中的外泌體富集miRNA；其他體液(如尿液、腦脊液、乳汁)中檢測到的miRNA也主要為外泌體源性miRNA[15]。miRNA通過與外泌體獨特的囊泡樣結構結合，使自身的化學性質更穩定，而外泌體源性miRNA可逃脫核糖核酸酶的消化，在人體循環中具有較好的生物穩定性，通過與細胞受體結合、細胞質膜融合將miRNA遞送至靶細胞，調節靶細胞的活動[16]。

2 外泌體源性miRNA在肺癌侵襲和轉移中的作用

2.1外泌體源性miRNA在肺癌血管生成中的作用 血管生成是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發展而成的新血管。在正常的生理條件下，血管生成是一個嚴格的、多重精確調節的過程。新生血管的生成對于腫瘤的生長至關重要，建立腫瘤的新生血管網絡是促進實體瘤侵襲和轉移的關鍵[17]。

Liu等[18]研究發現，外泌體源性miR-21能夠促進正常肺組織的血管生成，并促進其上皮細胞惡性轉化，與非吸煙者相比，吸煙者血清中外泌體源性miR-21的表達水平顯著升高；進一步試驗發現，香煙煙霧提取物誘導轉化的支氣管上皮細胞可通過外泌體將miR-21轉移至正常的支氣管上皮細胞，并通過促進信號轉導及轉錄激活因子3活化，導致血管內皮生長因子水平升高，促進人臍靜脈內皮細胞的血管生成和支氣管上皮細胞的惡性轉化。缺氧是肺癌等實體瘤的特征之一[19]。缺氧能夠改變肺癌細胞分泌的外泌體miRNA的種類和含量，而肺癌細胞分泌的外泌體源性miRNA反過來通過調節細胞間信號轉導，影響肺癌脈管系統生成，介導肺癌細胞微環境的低氧進化，從而影響腫瘤細胞的氧氣供應和營養供給；與正常氧條件下的親代細胞相比，低氧條件下的肺癌細胞可產生更多特定種類的外泌體，如肺癌細胞中的miR-23a水平顯著升高，并通過外泌體轉移至內皮細胞，直接靶向抑制內皮細胞中脯氨酰羥化酶1和脯氨酰羥化酶2的表達，導致內皮細胞中缺氧誘導因子-1α堆積，進而促進肺癌血管生成，增加肺癌細胞的血流供應[20]。因此，有學者提出，可以通過檢測外周血循環中特定種類的外泌體源性miRNA的變化實現對肺癌的早期篩查[21]。在基因調控方面，低氧條件下，肺癌細胞過表達的外泌體源性miR-619-5p可通過靶向抑制鈣調磷酸酶調節因子1.4誘導血管生成，有助于肺癌細胞獲取更多的血液供應以及遠處遷移、侵襲的機會[22]。外泌體源性miR-497可有效抑制腫瘤的生長以及肝癌衍生生長因子、細胞周期蛋白E1和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)A549細胞中的血管內皮生長因子A等相關基因的表達，進而抑制內皮細胞管狀樣結構形成和肺癌細胞的遷移[23]。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN)基因是一種磷酸酶，在負調控蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和胞外信號調節激酶通路中起核心作用，通過抑制內皮細胞增殖在血管生成中發揮關鍵作用。經輻射誘導的肺癌細胞分泌的外泌體miR-23a水平顯著升高，過表達的外泌體源性miR-23a可通過抑制PTEN的分泌，促進人臍靜脈內皮細胞的增殖和遷移，加速放療環境中肺癌細胞的血管生成，增強放療抵抗[24]。另有研究發現，肺腺癌來源的miR-142-3p通過外泌體向內皮細胞轉移，并通過抑制人轉化生長因子-β受體Ⅰ促進血管生成，進而促進肺癌細胞的遷移和侵襲[25]。因此，調控外泌體源性miRNA血管生成有望成為肺癌治療的潛在靶點。

2.2外泌體源性miRNA在肺癌EMT中的作用 EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，主要表現為典型的上皮細胞特征的喪失，而出現間質細胞相關的特征，如細胞黏附分子表達減少、細胞骨架中角蛋白水平降低、波形蛋白水平升高、細胞形態上具有間充質的特性等[26]。腫瘤細胞通過外泌體源性miRNA影響上皮細胞信使RNA翻譯，誘導EMT進程，使上皮細胞獲得更高的遷移、侵襲、抗凋亡、降解細胞外基質的能力[27]。

癌癥相關的成纖維細胞是腫瘤基質不可缺少的組成部分，可通過分泌細胞因子和外泌體與細胞相互作用，并與腫瘤細胞串擾，成為腫瘤EMT發展的一個重要因素[28]。癌癥相關的成纖維細胞來源的外泌體能夠提高肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的能力，增強神經鈣黏素和波形蛋白的表達，抑制上皮鈣黏素的表達；進一步研究發現，癌癥相關的成纖維細胞來源的外泌體源性miR-210可通過靶向上游移碼突變體激活PTEN/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/Akt通路，促進EMT，進而促進NSCLC的侵襲和轉移[29]。另外，肺癌干細胞來源的外泌體源性miR-210-3p可靶向結合成纖維細胞生長因子受體樣1并抑制其功能，進而上調神經鈣黏素、波形蛋白、基質金屬蛋白酶9和基質金屬蛋白酶1的表達，下調上皮鈣黏素的表達，從而促進肺癌細胞EMT[30]。Li等[31]通過微陣列分析將miR-181a鑒定為肺腺癌A549細胞系中EMT的新型調節劑，并通過功能測定確定了miR-181a靶向PTEN啟動子和調節PTEN表達的作用，與敏感細胞相比，miR-181a過表達時，對紫杉醇和順鉑耐藥的肺癌細胞更易轉移和具有EMT特性，同時PTEN表達降低，使肺癌細胞更具侵襲性。Rahman等[32]用來自高轉移性肺癌細胞和人晚期肺癌血清來源的外泌體對人支氣管上皮細胞進行處理，結果發現，處理后的支氣管上皮細胞中的上皮鈣黏素、緊密連接蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)和間質中的神經鈣黏素、波形蛋白的表達均顯著增加，證實來自高轉移性肺癌細胞和人晚期肺癌血清來源的外泌體能夠誘導支氣管上皮細胞EMT，增強其腫瘤化傾向。

骨髓間充質干細胞作為具有多種分化潛能的細胞亞群，是癌癥微環境的組成部分，可促進癌癥的進展[33]。用缺氧狀態下骨髓間充質干細胞來源的外泌體處理的肺癌細胞表現出明顯的EMT，即細胞形態轉化為紡錘形的間充質樣，細胞內波形蛋白和神經鈣黏素水平顯著升高；進一步研究發現，外泌體介導的miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100通過信號轉導及轉錄激活因子3誘導上皮細胞EMT，促進肺癌的轉移[34]。He等[35]研究發現，在高度轉移性肺癌細胞系及其外泌體中miR-499a-5p的表達均上調，過表達的外泌體源性miR-499a-5p可通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路促使內皮細胞中的上皮鈣黏素水平升高，而神經鈣黏素、β聯蛋白和波形蛋白水平均降低，促進肺腺癌細胞增殖、遷移和EMT。此外，低氧環境下，肺癌來源的外泌體源性miR-23a可被肺部內皮細胞直接內化吸收，不僅可以促進腫瘤血管的生成，還能靶向抑制ZO-1的表達，促進內皮細胞EMT[20]，增加血管通透性，使肺癌細胞更易通過血管內皮的間隙。

2.3外泌體源性miRNA在肺癌免疫調節中的作用 腫瘤細胞免疫逃逸可影響腫瘤免疫治療的有效性，外泌體介導的天然免疫細胞間的信號轉導對受體分子識別和信號啟動具有重要作用[36]。在抗腫瘤免疫過程中，負責加工處理抗原的樹突狀細胞通過外泌體將抗原呈遞給殺傷性T細胞來觸發抗腫瘤反應[37]。一些miRNA借助外泌體從腫瘤細胞轉移至靶向免疫細胞，影響機體免疫效應細胞功能的發揮，并協助腫瘤細胞免疫逃逸，增強腫瘤的侵襲和轉移能力[38]。Besse等[39]研究發現，樹突狀細胞來源的外泌體可發揮自然殺傷細胞效應子的功能，直接激活自然殺傷細胞，同時還可增強晚期NSCLC患者體內自然殺傷細胞的殺傷活性。乳腺癌細胞分泌的miR-231可以借助外泌體的包裹逃脫機體的免疫監控，并通過外泌體膜上過表達的整合素β4與肺表面活性蛋白C相互作用被NSCLC特異性內化，形成肺歸巢效應；外泌體源性miR-231進入肺癌細胞內部后通過阻斷PTEN/PI3K/Akt信號通路抑制A549肺癌細胞的增殖和遷移[40]。Fan等[41]發現，與正常體重的肺腺癌患者相比，肥胖肺腺癌患者的免疫治療效果更顯著；進一步研究發現，脂肪細胞來源的exo-miR-27a-3p可抑制誘導共刺激分子(inducible costimulatory molecule，ICOS)T細胞增殖和γ干擾素分泌，通過下調肥胖肺腺癌患者脂肪細胞外泌體源性miR-27a-3p的分泌，靶向作用于ICOS相關基因，可促進ICOS+T細胞增殖和γ干擾素分泌，進而影響腫瘤免疫微環境，抑制肺癌的侵襲和轉移。因此，通過研究外泌體源性miRNA在肺癌免疫調節中的作用機制，可以為抑制肺癌進展、開發針對肺癌的免疫療法提供新思路。

2.4外泌體源性miRNA在肺癌腫瘤微環境中的作用 腫瘤微環境指腫瘤細胞生活的內環境，除腫瘤細胞本身外，還包括其周圍的成纖維細胞、免疫細胞、炎癥細胞及膠質細胞等。腫瘤微環境被視為腫瘤對放療和化療產生抵抗的主要影響因素，在腫瘤細胞的起始、生長、遷移、侵襲過程中發揮關鍵作用[42]。外泌體源性miRNA被認為是腫瘤微環境的重要信息媒介，腫瘤細胞釋放特定的外泌體，通過與微環境中的其他細胞相互作用改造腫瘤轉移前的微環境，并通過局部或遠距離溝通調控受體細胞的表達，重新編程腫瘤的微環境，使其更有利于腫瘤的侵襲和轉移[43]。

誘導腫瘤轉移前的生態位形成是外泌體源性miRNA改造腫瘤微環境的重要手段。Lewis肺癌細胞來源的外泌體源性miR-3473b被肺成纖維細胞吞噬，通過阻礙核因子κB抑制劑δ的功能促進肺成纖維細胞核因子κB活化和肺癌細胞的肺內定植[44]。增加能量獲取是腫瘤細胞改造微環境的重要目的，腫瘤細胞可以通過分泌高水平的外泌體源性miR-122下調糖酵解中的丙酮酸激酶水平，抑制微環境中非腫瘤細胞的葡萄糖攝取，經能量代謝重編程，促使腫瘤細胞獲得更多能量攝入[45]。miR-182可通過上調NSCLC細胞中控制葡萄糖代謝的缺氧誘導因子-1α的表達促進葡萄糖代謝[46]。Zhai等[47]研究發現，miR-33b可通過靶向結合NSCLC細胞乳酸脫氫酶A的3′非翻譯區，下調乳酸脫氫酶A的表達，從而減少腫瘤細胞對葡萄糖的攝入，抑制腫瘤細胞的生長。Syndecan-1是一種跨膜蛋白聚糖，表達于肺上皮細胞，可以調節細胞增殖、遷移、黏附和存活。Parimon等[48]發現，缺乏Syndecan-1的肺癌細胞可以通過改變癌細胞釋放的外泌體miRNA的種類和數量，增強成瘤通路的信號轉導，促進腫瘤微環境的形成，進而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，因此Syndecan-1表達缺失的肺癌患者臨床預后一般較差。另有研究表明，miR-21可借助外泌體從肺腺癌細胞轉移至破骨細胞祖細胞，并靶向作用于程序性細胞死亡蛋白4基因，促進破骨細胞成熟和骨基質溶解，如骨基質溶解過多，儲存的生長因子(如人轉化生長因子-β受體)則大量釋放到微環境中，進一步促進肺癌細胞的侵襲和骨轉移[49]。Lawson等[25]發現，外泌體源性miR-142-3p不僅可通過抑制人轉化生長因子-β受體Ⅰ促進內皮細胞血管生成，還可增強肺癌相關成纖維細胞的表達，促進肺癌細胞微環境的形成。由此可見，外泌體源性miRNA不僅能夠調控肺癌細胞自身的微環境，還能遠距離誘導轉移前的生態位形成，影響肺癌的侵襲和轉移。

2.5外泌體源性miRNA在肺癌耐藥中的作用 耐藥是肺癌復發的最常見原因之一，盡管抗耐藥治療已取得一定進展，但腫瘤細胞的耐藥仍是癌癥治療的難點。近年來，外泌體源性miRNA的發現為探索腫瘤細胞耐藥機制提供了新的思路，相關研究表明，外泌體源性miRNA能夠將耐藥細胞的耐藥表型傳遞給敏感細胞，誘導腫瘤細胞形成耐藥抵抗，促進腫瘤的侵襲和轉移[50]。

順鉑是腫瘤治療最常用的化療藥物，但隨著治療的進展，腫瘤細胞逐漸對順鉑產生耐藥。有研究對NSCLC患者血清外泌體源性miRNA的分析發現，順鉑耐藥與順鉑敏感患者體內的6種循環外泌體miRNA(miR-425-3p、miR-1273h、miR-4755-5p、miR-9-5p、miR-146a-5p和miR-215-5p)水平相比差異較大；進一步研究發現，外泌體源性miR-146a-5p水平低的晚期NSCLC患者復發率較高，同時，在順鉑誘導的耐藥過程中，NSCLC細胞系或外泌體中的miR-146a-5p表達逐漸減少，表明miR-146a-5p過表達可以逆轉肺癌對順鉑的耐藥性[51-52]。外泌體源性miR-425-3p通過靶向Akt1上調自噬過程，而腫瘤細胞自噬的增加促進了NSCLC細胞中順鉑耐藥性的發展，導致藥物治療反應降低[53]。另有研究發現，順鉑可通過β聯蛋白信號通路上調NSCLC細胞中外泌體源性miR-425-3p的表達，過表達的外泌體源性miR-425-3p通過靶向Akt1促進受體細胞中的自噬激活，最終導致化學抗性；而miR-146a可以特異性結合細胞周期蛋白J信使RNA并促使其降解，同時誘導腫瘤細胞G0/G1期停滯、抑制細胞運動并促進細胞凋亡、增加肺癌細胞對順鉑的敏感性[54-55]。因此，血清外泌體miR-146a-5p和miR-425-3p可作為預測順鉑對NSCLC患者療效及實時監測耐藥性的新標志物。外泌體源性miR-96在肺癌患者(尤其是高侵襲性肺癌)中的表達增加，可通過靶向LMO7(LIM-domain only protein 7)促進肺癌進展，增加腫瘤細胞對順鉑的耐藥性，因此，外泌體源性miR-96被相關研究認定為肺癌的血清生物標志物，可作為早期肺癌的臨床篩查指標之一[56]。另外，外泌體源性miR-100-5p可以逆轉哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的表達，增強肺癌細胞對順鉑的敏感性，通過誘導增加miR-100-5p的分泌，有助于提高順鉑的化療效果[57]。

另外，對吉西他濱耐藥的肺癌細胞來源的外泌體源性miR-222-3p可通過窩莢蛋白和脂筏依賴的內吞途徑向敏感細胞轉移，并通過直接靶向細胞因子信號轉導抑制因子3的啟動子，增強敏感肺癌細胞的遷移、侵襲和抗失巢凋亡能力，同時也向敏感細胞傳播吉西他濱抗性[58]。攜帶表皮生長因子受體T790M突變的肺癌細胞釋放的外泌體源性miR-522-3p可以通過激活PI3K/Akt信號通路在敏感細胞中傳播吉非替尼耐藥性[59]。Zhang等[60]發現，對吉非替尼耐藥的肺癌細胞通過外泌體源性miR-214可以將耐藥轉移至其受體敏感的細胞，導致敏感細胞在后續的藥物治療中表現出相同耐藥性。

3 小 結

外泌體源性miRNA作為外泌體信號轉導的重要組成部分，在肺癌的侵襲和轉移中扮演重要角色。目前關于外泌體源性miRNA與肺癌侵襲、轉移相關性的研究多局限于單個外泌體源性miRNA在肺癌侵襲和轉移中的作用，而多個外泌體源性miRNA共同作用于肺癌調控網絡的相關研究仍較少。同時，受限于目前的外泌體提取技術，外泌體的定性和定量仍較難把控。而外泌體源性miRNA數量及質量的差異是否會影響外泌體源性miRNA調控肺癌侵襲、轉移的效果目前尚無定論，同時多個外泌體源性miRNA與肺癌信號通路調控之間是否存在協同或拮抗作用也仍未明確。因此，未來還應圍繞外泌體源性miRNA與肺癌侵襲和遷移之間的關系繼續深入探索。