外泌體：心肌缺血再灌注損傷干預新靶點▲

胡夢弦 何貴新 秦偉彬 吳成強 林 琳 王明遠 馮雨菲 鄭國坤

(1 廣西中醫藥大學研究生院，南寧市 530299，電子郵箱：2836923992@qq.com；2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院心血管二區，南寧市 530023)

【提要】 缺血再灌注損傷作為影響冠狀動脈介入術預后的常見影響因素，其嚴重程度與心臟功能的恢復息息相關，但目前對于該損傷尚無特別的防治手段。外泌體的出現，揭開了其新的治療領域。外泌體由多種細胞分泌，廣泛存在于各種組織細胞和體液中，對機體的內環境穩態具有調節作用，能夠通過調控各種因子改善受損的心肌細胞，對恢復心臟功能具有重要的作用。本文通過外泌體對心肌組織缺血再灌注損傷后心肌細胞的修復、巨噬細胞表型的調控、心肌纖維化及新生血管的增生等方面的影響進行綜述，望為心肌組織缺血再灌注損傷的治療干預提供新的思維方向。

冠狀動脈狹窄或栓塞是心肌組織缺血的主要原因之一，長期缺血將導致心肌細胞不同程度的功能代謝紊亂、損傷甚至死亡。經皮冠狀動脈介入術是目前治療冠心病的有效方式，其通過植入導管、球囊、支架等方式使狹窄或栓塞的血管再度通暢，恢復血流對心肌細胞的營養供給。但在恢復血供的同時可能會導致已受損的心肌細胞出現缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)，擴大心臟損傷的范圍，加重心肌重塑，或導致心力衰竭的產生。如何規避或降低該損傷對提高手術療效具有重要的意義。外泌體是一種可由多種細胞分泌的囊泡小體，其在機體內分布廣泛，可操作性強，能夠通過減輕心肌細胞炎癥反應、抑制心肌纖維化、促進心肌細胞的修復及新生血管的生成等方面減輕IRI。故本文針對外泌體對心肌IRI的干預機制研究進展進行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體簡介 外泌體是一類由多種細胞分泌的，富含蛋白質、脂質、DNA及各種RNA[例如mRNA、微小RNA(microRNA,miRNA) 和環狀RNA]的囊泡小體，直徑為30～150nm。目前公認的外泌體形成模式是：由細胞膜內陷形成多囊泡體，多囊泡體與內質網或細胞質膜融合形成一種管腔內囊泡從而釋放出胞外形成外泌體。研究表明，外泌體在機體的細胞分化、免疫應答、抗原呈遞等生命代謝過程中起著重要的調節作用。其作用方式可能包括：(1)外泌體直接作用于靶細胞膜表面信號分子進行信息傳遞交流[1]；(2)外泌體通過釋放信號分子作用于靶細胞膜表面的信號受體，從而進行細胞間的信號傳遞[2]；(3)外泌體囊泡膜與靶細胞細胞膜識別融合后，通過外泌體內容物的轉輸進行信息的轉運[3]。

1.2 外泌體提取方式 根據外泌體的體積、密度及表面特征性標志物，目前提取的方法可分為：(1)超速離心法，其根據外泌體的體積及密度在離心力作用、磷酸鹽緩沖液沖洗等流程后收集，適用于體積較大外泌體的收集，其工藝成熟，是目前外泌體收集的常用方法。(2)密度梯度離心法，是一種較超速離心法更為嚴格、純度更高的一種提取方式，通常將待分離溶液滴入至不同溶度梯度的蔗糖等小分子溶劑中，不同密度物質間存在沉降系數差，在離心力的作用下各物質以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶[4]。(3)超濾法，是一種根據外泌體體積進行分離的方法，其原理是利用半透膜的微孔結構，在一定外界推動力的作用下將外泌體選擇性回收；該方法的缺點是較大的囊泡和蛋白質被濾膜吸附，可能導致濾孔堵塞，影響外泌體的收集[5]。(4)免疫磁珠法，是運用核—殼的合成方法合成內含超順磁性物質、外裹特異性表面標記物的高分子免疫磁珠，這些免疫磁珠能結合相應的外泌體，在外加磁場的吸引下可做定向移動。

2 心肌細胞IRI的機制

IRI的發生涉及多種復雜的機制。目前，已知的機制包括：(1)氧化自由基增多。缺血心肌區域內的氧化自由基顯著增多，其能攻擊細胞及細胞內各種生物膜成分中的不飽和脂肪酸，破壞膜的完整及通透性、提高生物膜流動性，導致細胞水腫，細胞質疏松及細胞順應性降低。(2)線粒體穩態失衡。線粒體功能正常是減少IRI的關鍵因素。當心肌細胞發生再灌注損傷后，細胞內能量失衡，心肌細胞氧化應激和(或)三磷酸腺苷耗盡，隨后線粒體鈣負荷達到病理高水平，誘導線粒體內膜滲透率過渡孔開放，各種因子流入線粒體內，使得線粒體腫脹進而導致三磷酸腺苷的產生減少，細胞迅速死亡[6]。另一方面，來源于線粒體的超氧化物陰離子大量產生，負調節細胞內的抗氧化物，從而導致細胞損傷加重[7]。(3)鈣離子超載。Ca2+作為維持細胞內環境穩態的第二信使，在IRI發生時，由于心肌細胞膜上的Ca2+通道相關酶的活性降低，導致細胞內Ca2+濃度升高，激活磷脂酶進而溶解細胞內的生物膜，最終使得心肌細胞損傷或凋亡[8]。(4)炎癥反應。缺血再灌注誘導的炎癥在心肌細胞損傷和心功能障礙中起重要作用[9]。心肌缺血再灌注能誘導核因子κB信號通路的激活以及淋巴細胞分泌的細胞因子表達。而細胞因子可直接誘導心肌細胞凋亡，淋巴細胞可進一步加重心臟損傷。

3 外泌體對心肌IRI的影響

3.1 外泌體對巨噬細胞的作用 當發生IRI時，心肌細胞啟動凋亡程序，外周血管中的單核細胞逐漸向炎癥區域募集，在各種促分化因子的作用下，分別轉化成M1、M2型巨噬細胞，發揮促炎或抗炎等作用。研究表明，在急性心肌梗死出現后的3 d內，M1型巨噬細胞大量增加，在第3天達到高峰，且白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-8等細胞因子水平增高；在3 d后，M2型巨噬細胞數量逐漸增加，在5～7 d時，M1型巨噬細胞逐漸被M2型巨噬細胞所代替，且促進愈合因子水平增高，如成纖維生長因子及細胞因子IL-10等[10]。此外，在心肌損傷的同時，血液循環中的單核細胞被招募至受損心肌組織，取代原有的M2型巨噬細胞，然后分化為具有診斷性意義的M1型巨噬細胞，加重心肌損傷[11-12]。在心肌損傷的修復過程中，調節M2型巨噬細胞的水平確實能夠減輕心肌組織的損傷范圍，但不意味著要完全抑制M1型巨噬細胞的表達。Jia等[13]發現，完全抑制心肌組織中M1型巨噬細胞的表達并不能有效減輕心肌細胞的纖維化，而通過增加M2型巨噬細胞的數量，并減少M1型巨噬細胞數量，才能夠有效減輕小鼠心肌纖維化程度。因此，促進M2型巨噬細胞的產生對減輕心肌纖維化水平、降低IRI的嚴重程度具有重要的意義。外泌體作為一類由多種細胞分泌的囊泡物質，能夠調節巨噬細胞的功能，減輕炎癥反應。有學者將來源于人臍帶間充質干細胞的外泌體與單核巨噬細胞共培養，發現外泌體能夠有效促進單核巨噬細胞的增長，在一定水平上抑制M1型巨噬細胞的表達，并促進單核巨噬細胞向M2型巨噬細胞的轉化，同時可提高IL-10的表達水平，而降低炎性因子IL-8、IL-12的分泌水平，且這種作用效果與外泌體的溶度呈正比[14]。這對減輕心肌細胞炎癥、緩解IRI具有重要作用。

3.2 外泌體對心肌纖維化的抑制作用 當炎癥因子被抑制后，促纖維化信號增強，心肌組織進入纖維增殖期。成纖維細胞和肌成纖維細胞在心肌纖維化的形成中發揮著主要作用，正常的心肌組織中不存在肌成纖維細胞，當心肌纖維化開始時，成纖維細胞在信號因子的作用下大量增殖并轉化為肌成纖維細胞。心臟組織的纖維增殖期可分為兩大過程，即修復性纖維化(梗死區心肌重塑)和反應性纖維化(非梗死區心室壁重塑)。修復性心肌纖維化對于維持心室的功能、保護心臟的完整性至關重要，但過度的心肌纖維化將引起心室收縮力進行性下降，甚至導致心力衰竭的發生。因此，控制肌成纖維細胞水平對減少心肌瘢痕組織至關重要。轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是多效性細胞因子，對肌成纖維細胞的形成具有促進作用，研究表明,外泌體源性miRNA-425和miRNA-744能夠抑制TGF-β受體蛋白的表達而減少肌纖維的表達，從而抑制心肌纖維化[15-16]。方碩[17]通過對臍帶間充質干細胞來源的外泌體的蛋白質和核酸進行裂解，發現外泌體的核酸成分是抑制心肌細胞纖維化的主要物質，且核酸的主要成分是miRNA；在進一步的實驗中，其發現miRNA-23a和miRNA-125b通過抑制TGF-β/Smad通路來減少肌成纖維細胞的形成。研究顯示，miRNA-133a通過調節TGF-β1和CTGF的表達水平來抑制心肌纖維化，而轉染miRNA-133a的心房組織TGF-β1和CTGF的表達水平下降，而敲除miRNA-133a的成纖維細胞和心肌細胞中CTGF的表達水平上升，心肌纖維化水平也隨之改變[18-19]。由此可見，外泌體或通過miRNA抑制心肌細胞纖維化，從而減輕IRI的嚴重程度。

3.3 外泌體對受損心肌的修復作用 冠狀動脈狹窄導致心肌細胞長期處于缺血狀態，當支架植入后心肌組織恢復血供將會使心肌細胞發生IRI，如何將IRI降至最低是減少經皮冠狀動脈介入治療后遺癥的關鍵，而外泌體作為修復受損心肌的“治療劑”發揮著至關重要的作用。產進中等[20]發現，對大鼠心臟進行缺血預處理后，其血清外泌體含量明顯高于未經缺血預處理的大鼠，此外在IRI發生前將外泌體注入模型鼠靜脈內可使得心肌梗死面積顯著減少。心肌球源性干細胞(cardiosphere-derived cell，CDC) 是一類可以促進心肌細胞再生的心肌來源球細胞，研究表明，CDC分泌的外泌體可以復制CDC的心臟保護和再生作用[21]，能夠有效地抑制心肌細胞的凋亡[22]。 Gallet等[23]發現，在急性心肌梗死和慢性心肌梗死的豬模型中，將來源于CDC的外泌體注射到梗死的心肌內可明顯減輕IRI，提高左心室射血分數，并抑制心臟不良重塑。Xiao等[24]對心臟祖細胞進行氧化應激處理后發現，與正常細胞相比，心臟祖細胞能夠分泌更多的外泌體，并且外泌體中miRNA-21表達水平顯著提高，能夠通過恢復miRNA-21/程序性細胞死亡-4通路阻止心肌細胞發生氧化應激相關性凋亡。

3.4 外泌體對新生微血管形成的促進作用 促進新生微血管的形成是外泌體的一項重要功能，其包括促進微血管的生成和增殖。這些作用與外泌體的分化、遷移以及原有存在于血管中的外泌體有關。 Arslan等[25]發現，來自間充質干細胞的外泌體可以通過激活促生長因子信號，一定程度上恢復受損細胞的生物活性，并且減輕氧化應激反應，從而提高心肌活力，抑制心肌IRI后的不良重構。同樣有研究顯示，由間充質干細胞分泌的外泌體在微血管內內化后，對血管的生成及增殖和心肌細胞的修復發揮重要的作用[26]。研究表明，將來自間充質干細胞的外泌體注射到卒中大鼠體內，可以通過促進血管生成、神經突重塑和神經細胞新生來緩解癥狀[27]。此外，在缺氧條件下來源于臍帶間充質干細胞的外泌體不僅能夠促進臍帶血管內皮細胞的增生和毛細血管的生成，還豐富了臍帶毛細血管網，使得血流得以恢復[28]。還有研究表明，心臟祖細胞釋放的外泌體可通過促進內皮細胞遷移和血管內皮生長因子的分泌，誘導心肌組織和血管的再生，從而顯著改善心臟功能[29-30]。

4 小結與展望

心肌IRI是心梗后不可避免的病理過程，可造成心肌組織微循環障礙和細胞氧化應激損傷。外泌體作為由多種細胞分泌的囊泡小體，攜帶各種生物信號分子，其利用表面特異性膜蛋白與特定靶細胞結合，完成細胞間生物信號的特異性傳遞。目前大量研究表明外泌體能夠通過抑制炎癥反應減少心肌細胞受損，調節心肌纖維化、減低心臟瘢痕面積和促進新生血管的形成以改善心臟微循環。因此，以外泌體為研究靶點更深入地研究心肌IRI對心肌梗死患者的預后具有重要的意義。