不同源性外泌體在糖尿病足潰瘍修復中作用的研究進展

梁結梅 孫鐵輝 向鵬安 張偉 徐 姍

（1.河北北方學院研究生院，河北 張家口075051；2.中國人民解放軍94498部隊醫院，河南 南陽 474300 3.空軍特色醫學中心老年醫學科，北京 100142）

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，影響著全身多個系統，其患病率逐年上升[1]。糖尿病足是糖尿病最嚴重的并發癥之一，可導致足部出現感染、潰瘍和組織破壞，嚴重危害患者的身心健康，加重家庭及社會的負擔。糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcers，DFU）是糖尿病的嚴重并發癥,具有治療費用高，治療時間長、難度大，復發率高和預后差等特點，目前臨床治療存在一定的難度。近年來，外泌體（exosomes，Exos）作為無細胞治療慢性潰瘍的新興方法成為創面修復及再生醫學的研究熱點。Exos廣泛存在于各種活細胞及體液中，具有特異的功能性、靶向性和驅動機制，在細胞通訊中起著重要作用。研究表明，Exos具有調節免疫反應，修復和替換細胞，調節炎癥反應，促進肉芽組織形成、血管生成、傷口再上皮化，促進皮膚創面愈合和減少瘢痕形成等作用。本文對不同來源的Exos在DFU修復中潛在的作用綜述如下，以期為DFU的臨床治療提供新思路。

1 Exos的生物學特征及功能

1.1 Exos的生物學特征 Exos來自內吞膜，是直徑為30～150 nm的細胞外囊泡亞型，內含蛋白質、脂類、RNA和DNA等生物分子[2]，廣泛存在于各種體液，如血液、精液、唾液、血漿、尿液、腦脊液、附睪液、羊水、惡性胸腹腔積液、支氣管肺泡灌洗液和母乳等[3-4]。目前分離提取方法主要有標準超速離心、蔗糖梯度離心和聚合物沉淀、微流體過濾、無接觸分揀、免疫親和富集法等[5]。

1.2 Exos的生物學功能 Exos具有旁分泌作用，是細胞間通訊的重要載體，參與多種生理和病理過程，如清除衰老分子[6]、抗原呈遞[7]、通過在腫瘤細胞轉移過程中促進血管生成和腫瘤細胞遷移參與腫瘤進展[8-9]、抑制免疫反應[10]、通過與受體細胞相互作用傳播疾病等[11]。研究顯示，Exos主要通過減輕炎癥反應、誘導血管生成以及促進成纖維細胞和角質形成細胞的生長等機制加速慢性創面的愈合[12]，并且在免疫反應、細胞死亡、神經退行性疾病等疾病的病理過程中發揮著重要作用[13]。

2 不同源性Exos在DFU修復中的潛在應用價值

目前用于研究的治療慢性創面的外泌體衍生來源主要有間充質干細胞（MSCs）、內皮祖細胞（EPCs）、富血小板血漿（PRP）、人尿源干細胞（USCs）、巨噬細胞、唾液、表皮干細胞（EPSCs）、人羊水來源干細胞（hAFSCs）、自體真皮成纖維細胞（DFs）和人臍帶血漿（UCBs）等。其中MSCs來源又包括脂肪間充質干細胞（ADSCs）、骨髓間充質干細胞（BMSCs）、臍帶血間充質干細胞（UCMSCs）、胎盤間充質干細胞（PMSCs）和人經血來源間充質干細胞（MenSCs）。

2.1 MSCs源性Exos MSCs是具有自我更新、多向分化潛能的多能干細胞，來源于骨髓、脂肪組織、臍帶、羊水和胎盤等多種組織[14]，其在維持組織穩態和傷口愈合方面的作用已經得到證實。MSCs促進組織修復和再生的機制是產生大量抗炎細胞因子和大量Exos，抑制炎癥和調節靶細胞功能[15]，并且，MSCs分泌的關鍵產物Exos具有類似親代MSCs的作用[16]。鑒于MSCs衍生的Exos所具有的獨特的創面修復功能，其在創面修復中被認為是有應用前景的治療方法[17]。

2.1.1 ADSCs源性Exos 脂肪組織廣泛分布于人體中，并可通過微創手術大量獲取。與ADSCs相比，ADSCs源性Exos免疫原性低、穩定性更高且易于儲存，在再生醫學中有著廣闊的應用前景。在創面修復中，ADSCs源性Exos能調節免疫和炎癥反應、促進血管生成、加速皮膚細胞的增殖和再上皮化，并抑制導致瘢痕增生的膠原重塑，還可以作為載體和組合支架進行創面治療，從而實現無瘢痕皮膚修復[18]。在ADSCs源性Exos刺激下，成纖維細胞中I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、基質金屬蛋白酶1（MMP1）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的mRNA和蛋白水平均增加；此外，Exos通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路優化膠原沉積[19]，顯著加速了體內實驗中傷口的愈合。ADSCs源性Exos含有可抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的微小RNA（miRNA），通過刺激真皮成纖維細胞的增殖，促進皮膚成纖維細胞的再生[20]。Cooper等[21]將ADSCs源性Exos應用于人真皮成纖維細胞(HDF)，結果表明，Exos含有長鏈非編碼RNA（lncRNA）MALAT1和其他可能刺激HDF遷移和血管生成的因子，從而促進創面愈合。另有研究初步確定Wnt/β-catenin信號通路為ADSCs源性Exos在細胞增殖和遷移中起促進作用、在細胞凋亡中起抑制作用的潛在機制[22]。Li等[23]發現，ADSCs源性Exos在高糖環境中促進了EPCs的增殖和血管生成，使用過表達核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2 ，Nrf2)的 ADSCs源性Exos治療糖尿病大鼠模型足部創面，可觀察到潰瘍面積明顯縮小，并可在創面中檢測到肉芽組織和血管的生成，及生長因子表達水平增加，而炎癥、氧化應激相關蛋白水平降低。ADSCs源性Exos可以將微小RNA-125a(miR-125a)轉移到內皮細胞并通過抑制DLL4（delta-like 4)促進血管生成[24]，而過表達長鏈非編碼RNA linc00511的ADSCs源性Exos則通過抑制PAQR3基因誘導的Twist1泛素降解[25]加速血管生成，從而促進DFU等慢性潰瘍愈合。Shen等[26]證實, ADSCs源性Exos可以通過調節巨噬細胞炎癥反應來減弱損傷后的早期肌腱炎癥反應。 Bucan等[27]在ADSCs源性Exos中發現了神經生長因子轉錄本的存在，其在體外實驗中可增加神經突的生長，在體內實驗中可促進坐骨神經損傷后的再生。ADSCs源性Exos移植作為一種新穎的無細胞療法，具有調節炎癥、促進血管生成和皮膚創面愈合的作用，還能減輕肌腱炎及促進神經再生，并且易于獲取、存儲方便、免疫原性低，在DFU的臨床治療中具有較好的應用前景。

2.1.2 BMSCs源性Exos BMSCs不僅能夠分化形成骨、軟骨、脂肪、神經及成肌細胞等，而且有分泌多種生長因子的能力，在骨組織工程和再生醫學應用中備受關注。DFU除了涉及皮膚、肌肉、肌腱等軟組織的損傷外，還會對骨、軟骨和關節等造成破壞，增加了治療難度。研究顯示，攜帶miR-122-5p的BMSCs源性Exos能促進骨壞死兔模型的成骨細胞增殖[28]。體內實驗表明，使用過度表達miR-122-5p的Exos，骨礦物質密度、小梁骨體積和股骨頭的平均小梁板厚度均增加，并觀察到壞死股骨頭組織的再生。Takeuchi等[29]將BMSCs源性Exos應用于顱蓋骨缺損的大鼠模型，結果表明，BMSCs源性Exos通過增強血管生成在骨再生中發揮重要作用。有研究表明，局部施用BMSC源性Exos能有效促進纖維軟骨的形成，進一步研究發現，其主要機制是通過增加腱骨愈合過程中的M2巨噬細胞極化[30]。另外，Ding等[31]在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型全層皮膚傷口中應用去鐵胺刺激的BMSCs源性Exos，經過為期14 d的觀察，與對照組相比，BMSCs源性Exos治療組表現出傷口閉合速度更快、閉合率更高，并且促進生成新生血管和膠原纖維，愈合后的瘢痕更小。BMSCs源性Exos通過抑制TGF-β/Smad信號通路，有效促進HaCaT和HDF兩種類型的皮膚細胞增殖，從而促進大鼠皮膚傷口皮膚愈合[32]。這些發現為 BMSC源性Exos 在皮膚、肌腱和骨修復中的潛在臨床應用提供了基礎，相信未來通過對其機制的深入研究，有望成為治療DFU和骨髓炎的新療法。

2.1.3 UCMSCs源性Exos UCMSCs源性Exos在促進創面愈合方面具有與UCMSCs相似的功能，均能加速傷口閉合，減少瘢痕形成，改善皮膚附屬器、神經和血管的再生，并調節膠原纖維在傷口愈合中的自然分布[33]。在嚴重燒傷大鼠模型中，巨噬細胞的炎癥反應明顯，炎性因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）的表達顯著增加，IL-10水平降低。UCMSCs源性Exos中的miR-181c在調節炎癥中起關鍵作用[34]。動物實驗顯示，將UCMSCs源性Exos直接注射到小鼠的全層皮膚缺損中，可顯著加快皮膚傷口愈合[35]。UCMSCs源性Exos通過增強表皮再上皮化和真皮血管生成，起到減輕全層皮膚損傷的作用。 Liu等[36]研究證實，UCMSCs源性Exos通過遞送血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）促進血管生成來加速皮膚傷口愈合。此外，UCMSCs源性Exos還通過miR-21-5p和miR-125b-5p介導TGF-β受體抑制肌成纖維細胞和膠原蛋白I的過度形成，并增加體內和體外皮膚細胞的增殖和遷移[37]。雖然UCMSCs源性Exos被證實在皮膚創面修復中具有調節炎癥、促進皮膚愈合的積極作用，但用于DFU的臨床治療還有待進一步研究。

2.1.4 胎盤干細胞（PMSCs）源性Exos 人足月胎盤組織MSCs (PlaMSCs)是PMSCs常見來源，含有血管生成和血管抑制因子，可增強內皮血管的形成。PlaMSCs衍生的Exos被整合到內皮細胞中，刺激了內皮血管的形成和遷移，并增強了血管生成相關基因的表達[38]。Zhao等[39]在小鼠傷口愈合實驗中發現，人羊膜上皮細胞衍生的Exos可被成纖維細胞內化，從而刺激細胞遷移和增殖。將過表達miR-135a的人羊膜間充質干細胞來源Exos直接注射到傷口邊緣，可使傷口愈合速度更顯著[40]。這些研究揭示了PlaMSCs源性Exos在傷口愈合中對促進細胞增殖和血管生成起到了積極作用，但目前缺乏相關機制的深入研究，未來的研究尤其是臨床前期研究應側重機制方面的研究，將其開發成為慢性創面治療的新手段。

2.1.5 MenSCs源性Exos MenSCs是一種因非侵入性而易獲取、來源豐富的MSCs，具有較BMSCs更高的增殖能力。研究表明，MenSCs 源性Exos可通過誘導M1-M2巨噬細胞極化從而減輕創面炎癥，上調血管內皮生長因子A從而促進新血管生成，上調核因子-κB（NF-κB）的p65亞基和激活NF-κB信號通路而加速上皮化，并通過降低I型膠原蛋白∶III型膠原蛋白的比率來減少瘢痕形成[41]。MenSCs 源性Exos有效地減輕了創面炎癥反應，促進了創面的血管生成，促進創面愈合，作為可通過無創方式獲取的MSCs源性Exos，在再生醫學如DFU修復等難治性創面的應用中有著特殊意義。

2.2 EPCs源性Exos EPCs 是內皮細胞的前體，可通過促進新生血管生成的方式促進糖尿病潰瘍創面的修復。Zhang等[42]在動物實驗中發現，EPCs源性Exos具有促進血管生成和創面愈合的功能；他們在糖尿病大鼠背部建立全層皮膚缺損創面并局部注射EPCs源性Exos，結果顯示，與對照組相比，治療組的傷口有大量膠原蛋白沉積，形成的瘢痕更小，并且隨著Exos濃度的增加，傷口區域的再上皮化程度高，膠原蛋白更成熟，而且瘢痕的形成更少，并且在EPCs源性Exos處理的創面觀察到大量新生血管形成，且血管數量隨著Exos濃度的增加而增加，其主要機制可能是EPCs源性Exos通過Erk1/2信號轉導促進血管生成，從而促進皮膚傷口修復和組織再生。Hu等[43]證實了miR-21-5p在EPCs源性Exos中具有高度富集的特征，且特異性抑制內皮細胞內的血管生成和血小板反應蛋白-1（THBS1）的表達，以促進內皮細胞的修復。另外, miRNA-221-3p也是EPCs源性Exos中高表達的miRNA之一，可促進糖尿病小鼠的皮膚傷口愈合[44]。這些研究證實了EPCs源性Exos能有效的促進創面修復，并且揭示了其在慢性創面修復中的分子機制，為DFU的臨床治療提供了一種潛在的新方法，但是對于其最佳的有效治療劑量的研究尚屬空白，未來可針對此進行更深入的探索研究。

2.3 PRP源性Exos PRP內血小板分泌的生長因子含量豐富，在臨床上廣泛應用于慢性創面的治療，而PRP源性Exos可以封裝血小板中的主要生長因子，這一特性為其在創面修復中的應用奠定了基礎。Guo等[45]證明PRP源性Exos可發揮與PRP相似的創面修復功能。他們在糖尿病大鼠背部建立全層皮膚創面，并隨機分為對照組、海藻酸鈉水凝膠組、PRP凝膠組和PRP源性Exos凝膠組，給予相應治療，14 d后觀察到PRP源性Exos 治療組的傷口幾乎閉合。PRP源性Exos促進人微血管內皮細胞株HMEC-1細胞和成纖維細胞增殖、遷移的能力較PRP更顯著，其主要機制可能是Exos通過激活細胞外調節蛋白激酶（Erk）、Akt信號通路，增強了PRP誘導的血管生成能力；還能有效地促進體外HaCaT細胞的增殖、遷移，促進創面愈合[46]，其可能的機制是泛素特異性蛋白酶15通過促進真核翻譯起始因子4A1泛素化，從而增強了HaCaT細胞增殖和遷移的功能特性。 這些研究為PRP對慢性潰瘍愈合影響的潛在分子機制提供了有力佐證，并提出PRP源性Exos有望成為治療DFU不受物種限制的Exos生長因子資源，未來需要更多的臨床前期及臨床研究來探索其療效及最佳治療劑量。

2.4 USCs源性Exos USCs具有與MSCs相似的生物學特性，如細胞表面標志物表達譜、自我更新能力、多向分化、促血管生成旁分泌作用和免疫調節等。Chen等[47]在3名24～28 歲的健康捐贈者尿液樣本中分離出USCs源性Exos，局部皮下注射于糖尿病小鼠背部的兩個皮膚創面，發現USCs源性Exos能有效增強角質形成細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞等創面愈合相關細胞的增殖和遷移，對血管生成也有一定的促進作用。其功能分析發現，USCs源性Exos主要通過DMBT1蛋白誘導內皮細胞的血管生成反應，并促進血管生成和傷口愈合。USCs源性Exos能通過無創方式大量獲取，為DFU治療提供了又一新方向。

2.5 巨噬細胞衍生的Exos 有報道，在動物實驗中，巨噬細胞來源的Exos可減輕小鼠炎癥性疼痛模型中的熱痛覺過敏，在調節炎癥中發揮積極作用；此外，它們具有的免疫保護作用也受到關注[48]。Li等[49]證實了巨噬細胞衍生Exos通過抑制促炎酶和細胞因子的分泌發揮抗炎作用，并通過誘導內皮細胞增殖和遷移來促進糖尿病傷口的血管生成和再上皮化，從而實現加速傷口愈合的效果。巨噬細胞來源Exos具有強大的抗炎潛力，有望成為創面修復尤其是慢性感染性創面修復的有效治療方法，但機制還有待進一步研究。

2.6 唾液源性Exos 唾液中含有大量蛋白質和生長因子，可以加速傷口愈合，但其機制仍不清楚。Mi等[50]證實，唾液源性Exos在體外實驗中可誘導人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和血管生成，而在體內實驗中則表現出強大的促進皮膚傷口愈合能力。泛素結合酶E2O (UBE2O)是唾液Exos的主要mRNA之一，在體內、外實驗中，UBE2O的激活均表現出與唾液Exos相似的作用。研究者認為其主要機制為UBE2O通過降低SMAD同源物6 (SMAD6)的水平，激活骨形態發生蛋白2 (BMP2)，進而誘導血管生成。盡管唾液源性Exos代表了一種通過促進血管生成來促進創面修復的新策略，但要實現臨床應用，還需要深入研究。

2.7 EPSCs源性Exos EPSCs是一類具有無限增殖能力、可增殖分化為表皮中各種功能細胞的細胞群。Duan等[51]在皮膚缺損大鼠模型中研究了EPSCs源性Exos對皮膚傷口愈合的治療作用，發現EPSCs源性Exos顯著提高了大鼠的傷口愈合率，減少了瘢痕形成，并有效促進了皮膚附屬器、神經和血管的再生水平以及膠原蛋白的自然分布。此外，EPSCs源性Exos中富集了特定的 miRNA，包括miR-16、let-7a、miR-425-5p 和 miR-142-3p，這些特異性RNA通過降低真皮成纖維細胞中TGF-β1的表達，抑制肌成纖維細胞分化，從而減少瘢痕形成。EPSCs源性Exos在創面修復中能有效增加傷口愈合率、抑制瘢痕形成，未來有望用于DFU等慢性創面治療的無細胞療法中。

2.8 hAFSCs 源性Exos hAFSCs是胎兒間充質祖細胞，具有獨特的心臟保護和促進血管生成特征。Balbi等[52]報道hAFSCs能主動釋放具有顯著旁分泌潛力和再生作用的細胞外囊泡。這些囊泡具有誘導增殖、免疫調節和促進血管生成的能力，在骨骼肌萎縮模型中也表現出強大的再生潛力。據報道，hAFSCs源性 Exos包含let-7-5p、miR-22-3p、miR-27a-3p、miR-21-5p和 miR-23a-3p等miRNA，這些miRNA通過靶向TGF-β受體I型和TGF-β受體II型，抑制TGF-β信號通路的表達，從而加速創面愈合速度，并改善了毛囊、神經和血管的再生，還在創面愈合過程中促進了皮膚細胞的增殖和膠原蛋白的自然分布[53]。hAFSCs源性 Exos可能代表了一種在創面愈合過程中抑制纖維化瘢痕形成的無細胞治療工具，有望成為慢性創面的皮膚、神經和血管修復的新型無細胞療法。

2.9 DFs源性Exos DFs在皮膚再生和修復方面顯示出巨大的潛力。 Han等[54]發現，DFs源性Exos可以在體外逆轉高糖對人臍靜脈內皮細胞產生的損傷；研究者發現，在2型糖尿病大鼠模型創面局部皮下注射DFs源性Exos，可顯著促進創面的上皮再生、膠原沉積、皮膚細胞增殖和血管生成，并且有效地抑制炎癥，加速糖尿病皮膚創面愈合；其主要機制可能是DFs源性Exos激活了Akt/β-catenin通路。DFs源性Exos在創面愈合中發揮積極作用，尤其是其逆轉內皮細胞損傷的特性，頗受研究者的關注，但其潛在機制和在DFU臨床應用上仍需要更多的研究支持。

2.10 UCBs源性Exos 干細胞移植是近年創面修復的研究熱點。人臍帶血具有易獲取、低免疫原性及對供體無害等特點，是理想的干細胞來源。UCBs含有豐富的Exos，可穩定分離并安全儲存，并具有類似干細胞的促再生能力。Hu等[55]在體外實驗中發現，miR-21-3p 在 UCBs源性Exos 中高度富集，并通過抑制同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN) 和側枝發芽因子同源物 1 (SPRY1) ， 促進成纖維細胞的增殖和遷移，增強內皮細胞的血管生成活性。Kim等[56]使用人成纖維細胞進行劃痕傷口分析時發現 ，UCBs源性Exos通過促進M2巨噬細胞的血管生成和分化，減輕傷口的炎癥反應，促進組織增殖，表現出比成人血漿外泌體 (ABP-Exos) 更好的傷口愈合效果。UCBs源性Exos作為一種非常具有前景的Exos來源，具有減輕炎癥、促進血管生成和組織增殖的功能，有望成為創面修復的臨床新療法，但是其在DFU的應用有待更深入的研究。

3 總結與展望

Exos在急、慢性創面修復的各個階段都產生了積極作用，包括調節免疫反應、減輕炎癥、促進細胞增殖和血管生成，同時還能減少傷口愈合過程中的瘢痕形成，另外在肌腱和骨愈合中也有一定促進作用。更重要的是Exos不具有免疫原性，也沒有物種差異，信號可以跨物種傳遞[57]，因此有望從其他物種大量獲取，批量生產并作為無細胞療法用于臨床。然而，Exos的臨床應用仍面臨巨大的挑戰，包括提取方法的簡化、純度、變異性、最佳的來源及永生化、標準化的生產和分離程序以及最佳劑量和給藥途徑等[58-60]，如何實現商業化大批量生產也是亟需解決的問題。目前大部分Exos的臨床前期研究主要針對一般性皮膚傷口，應用在糖尿病和DFU動物模型上的研究有限，而且截至目前為止還沒有針對DFU的Exos治療的臨床試驗，更重要的是關于其治療的不良反應鮮有報道，要克服從實驗室到臨床使用的障礙，需要完善包括臨床前期及臨床試驗在內的研究來探索Exos的治療作用和機制，并找到可行的臨床實踐方案。