單細胞RNA 測序在賢移植排斥領域的應用及進展

熊旨雷，王振，付迎欣（天津市第一中心醫院賢移植科，天津 300192）

在過去的半個世紀里，因為免疫抑制劑的研發以及免疫抑制方案的優化，臨床器官移植無疑已取得了實質性的進展［1］。自從20 世紀80 年代鈣調磷酸酶抑制劑環孢素及20 世紀90 年代新的小分子和生物制劑被成功引進移植免疫抑制領域以來，賢移植術后排斥反應的發生率從40%下降到了10%～15%［2］，然而慢性排斥反應導致的移植物遠期存活率下降仍是一個亟待解決的難點［3］。相關研究表明，排斥反應的早期診斷和早期干預可以改善移植賢的預后［4］。

單細胞RNA 測序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術自2009 年發表以來得到了快速的發展［5］，不同于以往的測序技術，它能記錄一個復雜有機體或組織中每個細胞的轉錄狀況，為研究細胞間的異質性、描述不同細胞間的狀態及發現新的細胞類型提供了新的思路［6］。這種方法可以用于了解移植物中正在進行的免疫反應，從而可能為排斥反應的診斷、治療或預后提供新的思路和見解［1］。本篇綜述結合近年來發表的相關文獻，系統的闡述scRNA-seq 的技術發展以及其在移植賢排斥反應方面的應用及進展。

1 單細胞RNA 測序技術的起源和發展

人體不同類型的細胞雖然具有相同的遺傳物質，但它們的大小、形態、表型、細胞內容物、代謝活動以及功能卻不盡相同。這種細胞異質性很大程度上是由外部因素引起的，這些因素精確地調節細胞基因的表達和隨后細胞的活化、增殖、分化，從而產生不同類型和不同功能狀態的細胞［7］。在正常情況下，不同細胞發揮各自作用一起維持器官功能的穩定，往往其中一種或多種細胞的變化可能會導致疾病的發生，因此，在單細胞水平上對處于疾病狀態的組織或器官進行全面的評估，可以為診斷、治療和預后等方面提供有價值的信息［1］。

流式細胞術、原位雜交和免疫組織化學等傳統的實驗方法可以在細胞水平上提供部分信息，且這些方法也大大提升了我們對各種疾病發病機制的理解。然而，這些方法一方面只能同時獲取有限的基因表達信息，另一方面，雖然微陣列和二代測序技術可以同時獲取數千個基因表達的信息，但僅限于集合細胞的樣本，從而忽略了樣本中單個細胞的異質性。因此，這些方法在提供關于單細胞的轉錄信息方面都具有根本的局限性。

自Tang 等［5］在2009 年發表了第1 篇scRNAseq 論文以來，該項技術得到了不斷發展，基于單個細胞水平的基因表達譜分析和表達譜的動態功能描述已經成為新的研究方法［8-9］，這一強大的技術已迅速被廣泛用于神經科學、腫瘤和發育生物學等領域的研究［10-12］。直至最近幾年，該方法才被用于移植免疫學的研究。

所有的scRNA-seq 技術都有如下幾個共同的步驟：單細胞分離、細胞裂解和RNA 捕獲、逆轉錄、擴增、文庫生成、測序、數據分析［13］。 近年來，從單細胞懸液的制備、RNA 的擴增到復雜的cDNA文庫的生成都獲得了多項技術改進［14-17］。檢測通量的增加提高了scRNA-seq 的效率，但同時也增加了實驗設計和數據分析的復雜性。幸運的是，越來越多的利用R、Python 和 Matlab 等編程語言設計的統計和圖形軟件包可以簡化數據分析過程，使大量的測序數據可視化，便于研究者分析［18］。

2 移植腎的排斥反應及傳統基因測序

賢移植是終末期賢臟疾病或嚴重慢性賢臟疾病患者的首選治療方法，與透析相比，它提高了患者的生活質量，具有更好的生存優勢。根據組織病理學和免疫學特征，賢移植排斥反應可大致分為超急性排斥反應、急性排斥反應和慢性排斥反應，除了以上典型類型之外還可表現為亞臨床排斥反應、細胞和體液免疫反應同時存在的混合性排斥反應、以及急性排斥反應合并慢性排斥反應等［19］。目前，臨床上診斷排斥反應的金標準為移植賢的穿刺活檢，用光學顯微鏡、電子顯微鏡、間接免疫熒光以及有限的抗體對活檢組織進行染色分析，然而，近幾十年來的病理分析技術的進展十分有限，病理診斷結果也并非完全準確［20-21］。

傳統的基因測序已被多項研究用來探究移植器官功能障礙或程序性活檢組織中基因表達的模式［22-25］，通過比較某些同種異體移植病理中差異表達的基因來用于病理診斷，如急性細胞介導的排斥反應和抗體介導的排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR）［26-29］。當然，這些大規模的轉錄組數據分析幫助我們更好地理解復雜的移植活檢病理的同時也幫助臨床做出更加準確的診斷。AMR 是遠期移植賢丟失最常見的主要原因［30］，且病理科醫生對于急性賢小球炎等關鍵組織學病理改變的診斷存在偏差［31］。研究數據表明，轉錄組分析比傳統組織病理學診斷更好地預測了與AMR 診斷相關的不良結局，轉錄組分析的陽性預測值（PPV）和陰性預測值（NPV）分別為50%和94%［29］。利用整個組織樣本提取RNA 并使用微陣列技術進行轉錄組分析，已被用來臨床診斷移植賢的排斥反應和纖維化［23，32］。同理，有研究使用外周血樣本基因測序的方法來預測或診斷移植賢的排斥反應，Salomon團隊應用微陣列（基因芯片）技術，使外周血基因表達譜可作為一種微創手段，在急性移植賢功能障礙的背景下準確預測排斥反應［33］。Roedder 等［34］利用賢移植急性排斥反應評估研究中的大隊列，通過實時定量PCR 測定了一組預先確定的43 個基因的表達量，最終得到一個17-基因面板組（稱為kSORT）能夠在活檢發現前3 個月預測急性排斥反應，但該方法不能區分T 細胞介導和抗體介導的排斥。然而，上述所有這些方法都只是測量了樣本中的平均基因表達量，而忽略了細胞間表達的差異性，大量轉錄組分析可能錯過或低估差異表達的基因，而這些低表達水平的基因可能在疾病的發生發展中起重要作用［18］。

3 單細胞RNA 測序在腎移植排斥領域的應用及進展

近年來，因scRNA-seq 技術對單細胞轉錄組數據的分析優勢，使得該方法逐漸被應用于移植免疫學的研究。scRNA-seq 提供單個細胞水平的轉錄數據，通過數據可視化處理，能更加直觀準確的了解細胞動態變化過程，如疾病進展、細胞狀態的改變、細胞分化等。

目前，在賢移植領域，已發表的scRNA-seq 數據十分有限。Wu 等［35］發表了第1 篇關于移植賢混合排斥反應scRNA-seq 數據的文章，該研究本對1 例穿刺活檢時所取的16 G 有核細胞進行測序，使用InDrops 進行RNA 擴增和文庫生成，每個細胞的測序深度為50 000 個單位。共有4 487 個細胞通過了質量過濾器，平均每個細胞檢測到來自827 個不同基因的1 481 個轉錄本，利用T 分布和隨機近鄰嵌入（tSNE）對16 個細胞簇進行無監督聚類分析，包括3 種管狀細胞類型、3 種白細胞群、4 種淋巴細胞類型、3 種基質細胞類型、內皮細胞類型和循環細胞，這個數據集包含了所有的免疫細胞群，以及除了賢小球細胞的大多數供賢細胞類型。該研究得出了幾個有趣的結論，首先，通過不同類型細胞（FCN1 陽性細胞和CD16 陽性細胞）間的差異基因表達鑒定出兩種不同的單核細胞簇，并通過混合排斥組織樣本的免疫組化染色得到了證實，正常賢臟染色稀疏或缺失，AMR 活檢組織染色中等。其次，亞聚類分析定義了以下3 種不同的內皮細胞類型：靜息型、血管生成型和活化型。本文還證實了內皮細胞在AMR 中的重要性。從微陣列研究中發現的大多數與AMR 相關的高表達基因在內皮細胞中唯一表達，然而，在微陣列研究中被描述為內皮相關的基因大多在這個單細胞數據集中的非內皮細胞中表達，也就是說，既往的研究只是根據體外對人內皮細胞的基因表達的研究，推測微陣列研究中表達的基因來自于內皮細胞［36-37］。這突出了基于微陣列的方法在移植物病理研究中的一個主要局限性。當然，這篇文章的局限性是在單一的移植賢活檢的基礎上進行的，這些發現仍有待其他活檢和其他研究來證實。

近來，Liu 等［38］利用10×Genomics 技術測得2 例經傳統病理證實的慢性移植賢排斥反應（chronic kidney transplant rejection，CKTR）組織的scRNAseq 數據，并與GEO 數據庫中3 個健康成人賢臟的scRNA-seq 數據進行比較研究。通過使用無監督聚類分析確定了15 種不同的細胞類型，包括主要免疫細胞、賢細胞和少數幾種基質細胞。并通過進一步比較各細胞亞群信號通路的獨特特征，發現了與CKTR 不同功能相關的細胞亞型。對CKTR 生物學的研究提供了更深入的見解，將有助于CKTR 的診斷和治療的研究。Malone 等［39］利用外顯子序列中的單核苷酸變異體（single nucleotide variants，SNVs）的DNA 測序結合scRNA-seq 對5 個移植賢穿刺標本進行測序研究，探究在AMR 及非排斥反應的賢穿標本中供/受體來源的白細胞的持久性和轉錄特性。Dangi 等［40］在小鼠賢移植模型的基礎上，利用scRNA-seq 分析出高表達Alx 的骨髓細胞可促進供體特異性T 細胞的增殖和分化，并通過組織學證實與移植賢早期炎癥增強相關，為賢移植排斥反應的治療提供了新的潛在治療靶點。

盡管傳統測序技術提升了我們對排斥反應的研究深度和理解力，但這些方法僅僅只描述了活檢樣本中表達基因的“平均值”，那些在排斥反應中必然發生的細微病理差異可能無法被分辨，例如，AMR 的發生可伴或者不伴有C4d 沉積、存在DSA的情況下并不一定會發生排斥反應等臨床現象需要細微的分子和細胞差異來解釋。因為活檢樣本包含了從免疫細胞到賢細胞的多種細胞類型，傳統的測序方法也同時缺乏分辨既往忽略的在排斥反應中起作用的細胞類型甚至是新的細胞類型的能力［21］。而scRNA-seq 能從單細胞水平獲得組織病理的轉錄信息，能彌補傳統測序的不足。

4 單細胞RNA 測序在腎移植排斥反應領域現存挑戰及潛在應用價值

scRNA-seq 雖然有諸多優點，但其同時存在諸多技術限制。由于單個細胞含有極少量的RNA，在需要足夠量的樣本細胞的同時，生物和技術干擾在這種高度敏感的技術中是很難避免的［1］。此外，由于只有5%～50%的mRNA 可以被逆轉錄，通過該技術獲得的數據只能代表單個細胞的部分生物學過程［41］。制備單細胞懸液的過程對數據質量的影響至關重要，而實體器官單細胞懸液的制備是一大挑戰，在組織加工過程中溫度偏高時容易產生應激反應基因［42］，而這些轉錄信息不是被檢查細胞固有的，盡管這些數據可以通過生物信息學分析小心地去除，但在數據分析時也應保持警惕，數據分析方法目前仍需要進一步優化和發展。最后，盡管scRNA-seq目前測序成本已經大幅下降，但費用仍然昂貴。

5 展 望

應用scRNA-seq 對移植賢病理的單細胞分析有可能大大提高我們對導致排斥反應的相關機制的理解，特別是解釋AMR 的細微病理變化以及不同患者對抗排斥治療反應的巨大差異。scRNA-seq 將有助于更好地了解排斥反應中相關免疫細胞和驅動同種免疫反應的途徑。scRNA-seq 同時具備發現新的生物標志物的潛力（賢穿標本、血液、尿液等），同時，scRNA-seq 可以識別同種異體移植的病理特異性細胞狀態的標記物，有望幫助臨床病理區分排斥反應類型［18］。此外，新的免疫細胞治療靶點可能會增加我們目前有限的排斥反應治療的手段。