基于神經連接蛋白Neuroligins的研究及應用前景

歐陽俊琳(綜述)，朱小虎(審校)

(湖北醫藥學院附屬太和醫院骨科康復三病區，湖北 十堰 442000)

大腦通過突觸傳遞信號處理信息，突觸將神經元連接成巨大的通訊細胞網絡。在這些網絡中，突觸不僅傳輸信號，而且轉換和細化信號。神經連接蛋白Neuroligins(NLs)是突觸后膜細胞黏附分子，其連接突觸前和突觸后神經元，介導突觸間信號的傳遞，并通過特定的突觸功能塑造神經網絡的特性。筆者就NLs的構成、類型、功能及應用前景等進行綜述，旨在更好地認識NLs參與某些疾病的機制，并對其后續的臨床治療提供新思路。

1 NLs的構成

NLs屬于I類跨膜蛋白，位于突觸后膜。NLs的結構可大致分為3個區域，分別為胞外區域、跨膜區域、胞內區域。其中胞外區域，即NLs的N端，包括一個信號肽、乙酰膽堿酯酶樣區域(cholinesterase-like domain,CLD)及碳水化合物結合區域；跨膜區為O-糖基化(O-Glyc)的跨膜區域；NLs的C端為胞內區域，是I類突觸后致密區(postsynaptic density zone,PDZ)識別組件，NLs主要通過胞內區域與突觸后的靶蛋白，如橋尾蛋白(gephrin,GP)、突觸后密度蛋白(Postsynaptic density protein,PSD)等結合，從而促進突觸分化，加強突觸間隙的穩定性及傳遞突觸間信號的功能。其胞外區域可與突觸前膜的Neurexins(NRXNs)形成特異性的跨突觸連接。

2 NLs的類型

人類有5種NLs的基因型(NL1、NL2、NL3、NL4X、NL4Y)，嚙齒動物有4種(NL1、NL2、NL3、NL4)。NLs具有獨特的表達模式，NL1主要表達于興奮性突觸上，NL2主要表達于抑制性突觸上，NL3在興奮性和抑制性突觸上都表達，而NL4的表達似乎局限于視網膜神經膠質細胞的甘氨酸能突觸和中樞神經系統的其他幾個區域[1-2]。

3 NLs的功能

Wu等[3]研究表明，條件性刪除NLs，突觸的可塑性發生改變。突觸的可塑性是指傷害性刺激和環境變化等條件下，突觸的形態結構和功能發生相應的改變。突觸形態機構的可塑性主要變現為突觸數量和結構的改變。而突觸功能的可塑性主要分為短期突觸可塑性和長期突觸可塑性，目前研究最多的是長期突觸可塑性，它有兩種表現形式，即長時程增強(long-term potentiation,LTP)和長時程(long-term depression,LTD)，現將NL1-NL4的功能闡述如下。

3.1NL1的功能

3.1.1NL1對突觸的調控作用 Kim等[4]研究表明，NL1主要定位于興奮性突觸上，參與興奮性突觸后膜的形成。Prada等[5]研究顯示，NL1可通過波調節復合體介導的突觸后肌動蛋白重組，調控突觸結構和功能，對樹突棘的形成和突觸的穩定性起著關鍵的作用。NL1的胞內區域可直接招募波調節復合體到突觸后膜，激活LIMK/cofilin介導的信號通路，使F-肌動蛋白(F-actin)富集成網絡，使興奮性突觸后膜的表面積增大，促進興奮性氨基酸受體α-氨基-3-羥基-5甲基-4-異唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid,AMPA)向后膜插入，接受更多的興奮性神經遞質，改變突觸結構的可塑性，增強了突觸的傳遞效能。NL1與突觸前膜β-NRXNs的結合是LTP形成的關鍵。LTP是突觸后神經元對反復刺激突觸反應的持久強化，當小鼠的NL1基因被敲除后，NMDA/AMPA受體比值失衡，其海馬突觸中依賴NMDA受體的LTP減弱，突觸功能的可塑性被改變[6]。

3.1.2NL1與疼痛的關系 組織損傷誘導NL1表達上調，激活NMDA等相關受體，使突觸后Ca2+水平升高，突觸后膜受體磷酸化以及密度增加，引起突觸后膜去極化，使突觸后神經元興奮，最終導致疼痛的發生。NL1表達下調可抑制NL1與PSD-95相互作用和AMPA受體亞型GluAl突觸靶向，減少了谷氨酸能突觸傳遞，減弱了突觸的傳遞效能，調控了興奮性突觸的可塑性，改善了術后疼痛[7]。

3.1.3NL1與自閉癥和阿爾茲海默癥的關系 臨床研究表明，NL1基因變異與自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)、阿爾茨海默病中的記憶喪失、抑郁和創傷后應激障礙等神經精神障礙有關[8]，NL1的缺失或過表達也會造成空間記憶的受損，這提示NL1在認知過程中起一定作用。

3.1.4其他 小鼠腦皮質星形膠質細胞表達的NL1可通過與某些神經遞質相互作用調控星形膠質細胞的形態[9]。Liu等[10]研究顯示，NL1基因敲除小鼠不能保持清醒狀態，其非快速動眼睡眠時間增長。這些研究表明，NL1與疼痛、自閉癥以及睡眠都有密切的關系。

3.2NL2的功能

3.2.1NL2對突觸的調控作用 NL2主要定位在抑制性突觸上，對抑制性突觸的形成和功能發揮著重要的作用。體外非神經元細胞中NL2的表達誘導出與突觸連接相似的結構，而在體內突觸前的軸突蛋白與突觸后NL2的結合增強了抑制性突觸的傳遞[11]。條件性敲除NL2導致前額葉內側皮質的抑制性突觸數量減少，突觸傳遞效率降低，抑制性突觸的可塑性發生改變[12]。

3.2.2NL2對γ-氨基丁酸受體(gamma-aminobutyric acid receptor,GABAR)的調控作用 NL2與GP共定位，NL2通過酪氨酸殘基與GP結合，GP是一種腳手架蛋白，位于抑制性突觸，在募集甘氨酸和GABAR中具有重要作用。GP含有3個不同的結構域，分別為G、C、E結構域，其中C結構能夠與GABAR結合，調控GABAR在突觸后膜的整合。在神經元的發育過程中，NL2對GABA能突觸的形成至關重要；隨著神經元的成熟，GABA能突觸的發育需要NL2的參與；NL2與Slitrk3的相互作用對海馬的功能也起著重要的作用，選擇性破壞這種連接，會減弱GABA能突觸之間的傳遞，改變了突觸的可塑性，影響了海馬的功能[13]。

3.2.3NL2對抑制性突觸后電流(inhibitory postsynaptic current，IPSP)的作用 NL2通過GP和GABAARs使神經元具有成熟的電生理反應特性。NL2的過表達可以增加前額皮質錐形細胞的IPSP，NL2的缺失使小鼠內側前額葉皮質mlPSCs的幅度和頻率均降低，海馬齒狀回顆粒細胞中mlPSCs的幅度降低，但NL2表達上調和下調都沒有影響到興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current，EPSP)的水平變化[14]。

3.2.4NL2與認知的關系 在小鼠大腦海馬中注入NL2過表達病毒，使NL2在海馬神經元中過表達，導致GABA能突觸后膜的橋尾蛋白及其突觸前膜的囊泡GABA轉運體蛋白表達上調，增強了GABA能突觸的跨突觸連接，最終導致小鼠認知功能受損。NL2的基因改變與嚴重的認知障礙有關，這意味著它對認知功能也尤為重要[15]。人類全基因組分析已確定NL2中的拷貝數變異和錯義單核苷酸多態性與發育障礙有關，包括ASD和精神分裂癥。這些NL2基因的部分突變可在在轉基因小鼠模型中做到，NL2基因敲除小鼠在多種指標(如尾巴長度、睜眼年齡和身體長度)中表現出嚴重的發育延遲，并且其幼崽的發聲次數增加。另一方面，高表達NL2的小鼠壽命縮短、其后代的存活率降低、肢體蜷縮次數及重復行為增加，類似于Rett綜合征和ASD的相關癥狀。NL2基因的敲除和過表達也增加了小鼠的焦慮行為，改變了其社會行為，這提示NL2也參與了焦慮的調節[16]。總之，在小鼠海馬中，病毒介導的NL2過表達增強了抑制性突觸的連接，增強了抑制性突觸的傳遞效能；NL2條件敲除的小鼠，抑制性突觸傳遞顯著減弱，導致焦慮、恐懼、記憶和社交行為方面的并行損害。

3.2.5其他 小鼠受到的傷害性刺激增強了NL2與PSD95的連接，調控了AMPA受體亞型GluR1的突觸靶向性，參與了術后疼痛的發生[17]。也有研究表明，NL2參與胰腺細胞胞外分泌的同時，還可通過調節內皮細胞的細胞因子CDC42的釋放，從而調控血管生成素2(angiopoietin 2,Ang2)的釋放，最終影響血管的生成[18]。這說明NL2不僅影響大腦的發育及認知，還有可能參與疼痛及某些內分泌系統疾病的發生。

3.3NL3的功能

3.3.1NL3對突觸的調控作用 NL3在興奮性和抑制性突觸上都有表達，對突觸的成熟和傳遞都起著重要的作用。NL3的錯義突變會使紋狀體背側的谷氨酸能突觸的長時程抑制(long-term depression,LTD)受損，影響其突觸功能的可塑性[19]。

3.3.2NL3對IPSP與EPSP的作用 NL3錯義突變小鼠可致海馬和軀體感覺皮層的興奮性和抑制性突觸傳遞失衡，杏仁核基底側的EPSP幅度增加，IPSP的幅度降低[1]。進一步研究表明，神經元中NL3的缺失，會使興奮性突觸上的AMPARs減少，興奮性突觸傳遞減弱，最終導致mEPSC頻率的降低[19]。

3.3.3NL3與自閉癥的關系 NL3是眾多與自閉癥相關的基因之一，NL3錯義突變小鼠會使中間神經元的興奮性降低，GABA能突觸的功能紊亂，其社交活動受損。當人的NL3基因發生了錯義突變后，突觸數量會減少，導致人的ASD的發生，記憶和社會交流活動受損[20]。

3.3.4其他 小鼠的NL3錯義突變可使其交配行為發生改變，且雌性小鼠尤為明顯。另有研究顯示，與野生型大鼠相比，NL3基因敲除大鼠的非快速動眼睡眠時長減少，而快速動眼時長增加，并且某些腦電圖的頻率上也表現出相應改變[10]。這表明，NL3不僅與自閉癥相關，還與交配行為及睡眠相關。

3.4NL4的功能

3.4.1NL4對突觸的調控作用 NL4在小鼠的整個大腦中都有表達，且主要分布在甘氨酸能突觸上，細胞免疫組化顯示，NL4在前腦內有微弱而彌散的分布，大多數在其他腦區，NL4與抑制性突觸的標記物可共定位。NL4基因敲除的小鼠引起視網膜上甘氨酸能突觸傳遞與海馬CA3區GABA能突觸傳遞的輕微減少，皮質中的GABA能和谷氨酸能突觸中的突觸前囊泡池的大小和釋放概率也降低了，但興奮性突觸間的傳遞功能沒有受損。與NL4基因缺失不同，在培養的海馬神經元中，NL4的過表達減少了谷氨酸能而不是GABA能的突觸傳遞[21-22]。這些研究表明，NL4對抑制性突觸的傳遞發揮著重要的作用。

3.4.2NL4與自閉癥的關系 較多研究表明，NL4與自閉癥相關，NL4基因缺失的小鼠，GABA能突觸傳遞受損，抑制性突觸可塑性發生變化，導致小鼠表現出自閉癥相關癥狀，如社交功能受損、重復行為增加等[23]。

4 基于NLs的應用前景

抑制NL1與PSD95的相互作用和與GluA1亞基的突觸靶向，脊髓中NL1的表達會下調，術后疼痛減輕；大鼠經過電針鎮痛后，NL1的表達上調[7]，這說明NL1可能參與了疼痛的發生。這在治療疼痛的方法中值得進一步研究。Fang等[24]研究表明，敲低癲癇大鼠的NL1的表達，抑制了神經元的過度興奮，降低了癲癇發作的嚴重程度，并且增加了癲癇發作的潛伏期，這說明NL1可能也參與了癲癇的發生，這也可能是治療癲癇的潛在新目標。

NL2衍生肽覆蓋的聚酰胺基(polyamidoamine,PAMAM)樹狀聚合物可增強胰腺β細胞的增殖和功能。這可能為設計具有獨特作用方式的創新型抗糖尿病藥物提供新的方案。NL2還可調節血管生成素2從內皮細胞釋放和血管生成[18]，這可能成為腫瘤血管生成到血管疾病的各個領域中的新治療靶標。Heshmati等[25]研究顯示，NL2在抑郁癥和應激易感性中的細胞類型特異性作用，這又為抑郁癥等相關疾病的針對性治療提供新思路。

神經膠質瘤是兒童和成人腦瘤死亡的主要原因，介導這種腦瘤神經調節的重要機制分子是NL3，其可通過激活PI3K/AKT通路，促進神經母細胞瘤細胞的增殖和生長，因此，降低NL3的表達或許可以抑制神經母細胞瘤細胞的生長。并且，NL3基因敲除的大鼠表現出ASD相關表型，NL4基因敲除的小鼠也表現出自閉癥相關癥狀。這說明NL3和NL4可能都參與了自閉癥的形成機制，這對治療自閉癥指明了新的方向。

5 結語與展望

綜上所述，神經連接蛋白NLs可通過調節突觸的可塑性參與疼痛及神經精神等疾病的發生。NL1通過調節興奮性突觸的可塑性參與疼痛與癲癇的發生；NL2的敲除或過表達都會改變抑制性突觸的可塑性，從而影響大腦的發育及認知功能；NL3既可調節興奮性突觸的可塑性，也可調節抑制性突觸的可塑性，NL3發生錯義突變后會導致自閉癥的發生；NL4主要調節抑制性突觸的可塑性，NL4基因的缺失會導致GABA能突觸的傳遞受損，最終導致自閉癥的發生。神經連接蛋白NLs還與糖尿病、腫瘤等疾病的發生密切相關。

若對疼痛以及神經精神等疾病的治療可以從傳統的藥物、針灸、神經阻滯、射頻消融等療法轉向與突觸可塑性相關的神經連接蛋白NLs的靶向治療上，或許可以為臨床治療提供新思路，但是，這仍然是一個漫長的過程。神經連接蛋白NLs參與疼痛及神經精神等疾病的機制較為復雜，需要更加深入地研究，早日將基礎研究有效轉化成臨床結果。